[发明专利]一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将大麻素受体基因CB1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；所述大麻素受体基因CB1为人源大麻素受体CB1基因，荧光蛋白为copGFP；

2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；所述空白对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1-copGFP慢病毒，将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293；

3）步骤2）检测组培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F，以测得的荧光值Ca²⁺F/荧光值PF比值作为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；

4）步骤2）检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF₁和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F₁，对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF₂和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F₂，计算得到荧光值Ca²⁺F₁/荧光值PF₁比值与荧光值Ca²⁺F₂/荧光值PF₂比值之差，并代入步骤3）回归方程，即可计算出检测样本中的大麻素类活性物质含量；

步骤1）构建的质粒为pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达所述pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒；

步骤2）中，所述真核永生化细胞为慢病毒包装细胞293V，建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293；并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1的单克隆细胞系CB1·copGFP/293；

步骤3）和步骤4）中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fura Red。

2.如权利要求1所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组培养液加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL和1.6ng/mL的5种检测组标准液。

3.如权利要求1所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择482nm单波长激发，以507nm和640nm双波长检测，其中507nm波长下检测胞内荧光蛋白的荧光值PF，640nm波长下检测荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F。