[发明专利]一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒。本发明可实现所有阿片类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然阿片类产品、还是合成阿片类分子，包括层出不穷的新型合成阿片活性物质，如芬太尼及其各种衍生物，可解决新型合成阿片类精神活性物质监管难的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

对于吸毒人员吸食新型阿片类精神物质，如芬太尼的检测和监管是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗芬太尼抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但芬太尼在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成的芬太尼层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也难以实现监管检测。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。

本发明构思为：无论是天然阿片类物质，还是各种各样的合成阿片类精神物质，如芬太尼及其衍生物，其在机体内都会作用到阿片受体这个靶点，从而产生其生物学效应。阿片受体至少包括μ型、k型、δ型、和σ型四种阿片受体，μ型阿片受体是吗啡、芬太尼等阿片类精神物质亲和力和作用最强的受体。阿片受体属于GPCR类，当受到阿片类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号使内质网内储存的Ca²⁺迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答，如神经细胞释放多巴胺。由于多巴胺的测定有成熟的ELISA检测试剂盒，因而我们通过建立稳转MOR1的神经母细胞瘤细胞系MOR1/SK-N-SH，建立一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质检测方法，应用于快速、高效、精准、高通量的检测各种样品中的阿片类活性物质。

所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将阿片受体基因克隆到CMV启动子下，构建真核表达质粒；

2）将步骤1）真核表达质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立阿片受体稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液；

3）步骤2）检测组细胞培养液中加入标准品并充分反应，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；

4）步骤2）检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD₁值；步骤2）对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD₂值；计算吸光度OD₁值与吸光度OD₂值之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的阿片类活性物质的效应含量。