[发明专利]一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将阿片受体基因克隆到CMV启动子下，构建真核表达质粒；

2）将步骤1）真核表达质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立阿片受体稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液；

3）步骤2）检测组细胞培养液中加入标准品并充分反应，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；

4）步骤2）检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD₁值；步骤2）对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD₂值；计算吸光度OD₁值与吸光度OD₂值之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的阿片类活性物质的效应含量。

2. 如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，所述阿片受体基因为人源μ型阿片受体MOR1基因；所述真核表达质粒为pCMV-MOR1质粒，其构建过程为：将人源μ型阿片受体MOR1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达质粒pCMV-MOR1。

3.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞；建立阿片受体稳转的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCMV-MOR1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-MOR1慢病毒；将CMV-MOR1慢病毒感染SK-N-SH细胞得到MOR1/SK-N-SH稳转细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选MOR1/SK-N-SH稳转细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/SK-N-SH。

4.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo空载体、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到空载体慢病毒；将空载体慢病毒感染SK-N-SH细胞得到Neo/SK-N-SH稳转细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选Neo/SK-N-SH稳转细胞，并通过挑取克隆的方法获得空白对照细胞系Neo/SK-N-SH。

5.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组细胞培养液中加入标准品并充分反应，配制标准品浓度分别为0.01、0.05、0.25、1.25、6.25ng/ml的5种标准液，所述标准品为吗啡。

6.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组细胞培养液中加入标准品并充分反应，配制标准品浓度分别为1、3、9、27、81pg/ml的5种标准液，所述标准品为芬太尼。

7.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤4）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。

8.一种阿片类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒。