[发明专利]通过有效转录终止来改进RNA的产生和递送的组合物和方法

说明书

提供了用于高效产生和递送双链RNA(dsRNA)的组合物和方法。描述了用于dsRNA的体外和体内表达的载体构建体。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生dsRNA的细胞表达系统以及用于向目标生物提供表达的dsRNA的方法和组合物。所描述的组合物和方法可用于产生用于筛选或其它用途的RNA分子，或扩增用于分析的RNA序列。

本申请是申请日为2014年3月13日、申请号为201480024780.1、发明名称为“通过有效转录终止来改进RNA的产生和递送的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。

关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15提交的美国临时专利申请第61/793,506号(其通过引用整体并入本文)的权益。

序列表的并入

本申请含有通过EFS网络与其一起电子地提交的序列表，该序列表含有2014年3月10日创建的大小为11,512字节(于Windows XP中测得)的名为“P34118WO00_59609_2014_03_10_v2ST25.txt”的文件，并且该文件通过引用整体并入本文。

发明领域

提供了用于RNA的体外和体内表达的载体构建体。还提供了用于体内产生RNA和蛋白质的细胞表达系统。还提供了用于向目标生物提供体内转录的dsRNA的方法和组合物。

背景技术

经济作物往往是被病毒或害虫诸如昆虫或线虫攻击的目标。虫害和病毒感染可对作物产量具有显著的负面影响。化学农药已经非常有效地消灭虫害；然而，使用化学农药也存在不利方面。化学杀虫剂不具有选择性，并可能对益虫和其它生物以及目标害虫产生作用。化学杀虫剂长期存在于环境中，并且代谢(即使有的话)通常很缓慢。它们积聚在食物链中，特别是在高等食肉动物物种中，在所述动物中可断定它们是有负面作用的。化学杀虫剂的积累也导致对所述试剂的抗性产生。因此，需要用于控制或消除植物上或植物中的虫害的替代方法；具有选择性，环境惰性，非持久性，可生物降解，并且非常适合抗病虫害管理方案的方法。

已经显示双链RNA(dsRNA)分子通过称为RNA干扰(RNAi)的机制介导对各种生物中的特定靶基因的抑制。RNAi干扰利用了内源细胞途径，凭借该途径包含大体上对应于靶序列的有义和反义序列的互补核苷酸序列的双链RNA介导目标mRNA的降解或减少蛋白质从mRNA模板的翻译。RNAi途径的效应蛋白包括从原始dsRNA产生小的干扰RNA(siRNA)的切丁酶蛋白复合物，和使用siRNA引导来识别相应的mRNA并降解其或阻断从其的翻译的RNA诱导沉默复合物(RISC)。只有与siRNA互补的转录物受到影响，从而mRNA表达的敲低通常是序列特异性的。RNAi的基因沉默作用可以持续数天，在实验条件下，可在某些情况下导致90％或更多的目标转录物的丰度的减少，从而导致相应的蛋白质的水平的下降。蛋白水平也可在不显著影响mRNA转录水平的情况下通过阻断翻译来扰动。

虽然dsRNA分子显示作为用于控制或消除植物虫害的具有选择性、环境惰性的化学杀虫剂的替代物的希望，但对可通过常规体外和体内表达法来产生的dsRNA的量的限制和与产生和纯化dsRNA相关的成本呈现阻挡其用于控制作物植物的虫害和疾病的障碍。因此，需要用于生产商业规模量的dsRNA的高效且具有成本效益的方法。

发明概述

本文所述的几个实施例涉及用于RNA的体外和体内表达的载体构建体。在一些实施方案中，所述RNA是双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，所述RNA编码蛋白。在一些实施方案中，所述RNA是调控RNA。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生RNA的细胞表达系统。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生蛋白质的细胞表达系统。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生dsRNA的细胞表达系统和用于向目标生物提供表达的dsRNA的方法和组合物。所描述的组合物和方法可用于生产用于商业制剂的RNA分子，以扩增用于分析、筛选和其它用途的RNA序列。