[发明专利]一种狂犬病毒抗体定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法

权利要求书

1.一种狂犬病毒抗体定量检测试剂盒，包括免疫层析检测试纸条和样品稀释液；

所述免疫层析检测试纸条由一端至另一端依次包括：包被狂犬病毒抗原的样品垫、包被抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的标记垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于背板的上表面；其特征在于，

其中，样品垫包被的狂犬病毒抗原为狂犬病毒样颗粒，狂犬病毒样颗粒的基本组装元件包括狂犬病病毒G蛋白和M蛋白，其中，编码G蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码M蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，狂犬病毒抗原是由狂犬病毒CTN-1株糖蛋白经Bac-to-Bac杆状病毒-Sf9昆虫细胞表达系统表达的病毒样颗粒，样品垫包被的狂犬病毒抗原的蛋白浓度为0.5-2.0g/L；

检测线包被有抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，检测线包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为1.0-2.0g/L；

质控线包被有金黄色葡萄球菌A蛋白，质控线包被的金黄色葡萄球菌A蛋白的蛋白浓度为1.0-2.0g/L；

标记垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体由胶体金或荧光微球标记；金标垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为50μg/ml，荧光垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为0.01mg-0.05mg/ml；

样品稀释液为含有10-20mmol/L硼砂，0.2-6％NaCl，0.1-0.5％Tween-20，0.1-0.5％NaN₃，pH值为8.2-8.6的溶液；

所述试剂盒通过以下步骤制备：

S1、样品垫制备：制备和纯化狂犬病毒抗原，将纯化后的狂犬病毒抗原用内含2％的Tween-20的20mM四硼酸钠溶液稀释成0.5-2.0mg/ml，喷涂于玻璃纤维素膜上，作为样品垫；

S2、标记垫制备：将固含量为1％的微球悬浮液采用超声分散均匀，用超纯水10倍稀释；按照体积比1:25分别加入浓度为50mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和浓度为50mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，混匀，常温下反应0.5小时；将反应后的悬浮液分散均匀，按照蛋白浓度0.01mg-0.05mg/ml加入抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，反应1-2min后，再超声20-40秒，然后再反应1小时；加至BSA终浓度为0.50％，进行封闭1-2小时；以10000r/min离心15-20min，溶于含1％牛血清、4％蔗糖、0.5％酪蛋白、pH 6.0的0.01M硼酸缓冲液，喷涂在玻璃纤维上，作为标记垫；或者，用0.2mol/L K₂CO₃将25-40nm的胶体金溶液调节pH值为8.4后，将抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体按照蛋白浓度为50μg/ml，加入胶体金溶液中并继续搅拌30分钟；加入10％BSA至终浓度为1％，搅拌30分钟，以10000r/min离心30分钟，吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的胶体金标记的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，溶于含3％BSA、3％蔗糖、0.2％Tween-20和0.1％NaN₃的20mmol/L Tris-HCl溶液，喷涂在玻璃纤维上，作为标记垫；

S3、硝酸纤维素膜包被：检测线包被的为1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；质控线包被的为1.0-2.0g/L的SPA，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；

S4、试纸组装：采用样品单向层析组装方式，在背板上的一端至另一端依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后切条、密封，4-30℃保存。