[发明专利]颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用

权利要求书

1.颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且具鸟氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且具有鸟氨酸脱羧酶活性的核苷酸序列。

3.一种获得高产莨菪碱和山莨菪碱颠茄品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：在颠茄中超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶，获得转基因颠茄品种，即获得高产莨菪碱和山莨菪碱颠茄品种；

所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且具鸟氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在颠茄中超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶的方法如下：构建含编码颠茄鸟氨酸脱羧酶基因的植物重组表达载体，构建转化子，转化颠茄，诱导再生，筛选转基因植株，即获得超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶的颠茄。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述含编码颠茄鸟氨酸脱羧酶基因的植物重组表达载体由以下方法构建：将SEQ ID NO.3所示序列通过BglII和BstEII连入1305⁺植物过表达载体；所述1305⁺植物过表达载体为pCAMBIA1305载体上的hygR基因替换为gus基因，获得中间载体，然后再将pBI121的GUS表达框通过BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的中间载体而得。

6.颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为鸟氨酸合成腐胺的催化剂中的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组颠茄鸟氨酸脱羧酶由以下方法制备：以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物，颠茄cDNA为模板经PCR扩增AbODC编码区，然后经扩增获得的序列经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的原核表达载体pET28a⁽⁺⁾中，获得重组质粒pET28a⁽⁺⁾-AbODC，然后将转化大肠杆菌Rosetta，获得含pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒的工程菌，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，纯化，获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述纯化为使用Proteinlso Ni-NTAResin填料装柱，填充后静置30-60min后，ddH₂O冲洗洗去原装填料液体中的酒精，后用5倍体积的平衡缓冲液冲洗柱子后，再加入5倍的平衡缓冲液平衡树脂，静置1h；待柱子平衡结束后，加入重组蛋白上清液，流速调低至20滴/min，使目的蛋白与镍柱充分结合，待上样结束后，用平衡缓冲液冲洗镍柱，去除柱子上残留的不能与柱子结合的蛋白；再用100mM的咪唑洗脱，调节流速至60滴/min，收集洗脱液，即获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。

9.颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为赖氨酸合成尸胺的催化剂中的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

10.重组颠茄鸟氨酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物，颠茄cDNA为模板经PCR扩增AbODC编码区，然后经扩增获得的序列经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的原核表达载体pET28a⁽⁺⁾中，获得重组质粒pET28a⁽⁺⁾-AbODC，然后将转化大肠杆菌Rosetta，获得含pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒的工程菌，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，纯化，获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。