[发明专利]一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法。所述的构建方法，借助Tet‑on 3G系统构建含永生化因子的可控永生化逆转录病毒载体，包装逆转录病毒感染脐带间充质干细胞，通过添加诱导物诱导永生化因子基因的表达，将其转化为具有高增殖能力的永生化细胞；当需要将细胞用于正常生理或疾病治疗时，撤销诱导物，永生化因子基因处于转录关闭状态，细胞回复原代脐带间充质干细胞特性，在基因功能研究或是疾病治疗中都具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法。

背景技术

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)是一类来源于中胚层具有多向分化潜能的基质细胞，免疫原性低且具有免疫调控功能，在基因治疗和细胞替代治疗、免疫性疾病方面有着广泛的临床应用前景。然而，hUMSCs与机体其他正常细胞一样，经过有限次的细胞传代后，出现细胞停止增殖，发生衰老和死亡，即细胞老化现象(cell senescence)。研究显示，hUMSCs在体外培养约10-30代左右出现细胞老化，这就阻碍了hUMSCs在临床应用和机制方面的研究。若可以将hUMSCs永生化，使其能够避免细胞培养过程中出现老化、干性消失，保持多潜能分化状态，不仅能为细胞生物学的研究提供稳定性状，在基因治疗、细胞治疗等研究方面也具有潜在的应用价值。

细胞永生化是指细胞自发或受体外因素影响能克服增殖危机，具有无限增殖的能力。1998年，Bodnar和Ouellette等将人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reversetranscriptase，TERT)转染到原代视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞中，细胞寿命至少延长了20倍。2003年，Cui将TERT基因转染到绵羊成纤维细胞中，携带TERT基因的成纤维细胞能够连续培养500天以上，未携带TERT基因组只能连续培养200天左右。因此，通过转入外源性的永生化基因TERT来获得细胞永生化状态。目前也有通过将重组到慢病毒载体的TERT基因转染hUMSCs使其延长寿命的方法，但是转化的细胞会在细胞表型或代谢方式上和原代分离的细胞有所差异。另外，将病毒转化的细胞连续不可控的表达永生化因子TERT的细胞模型替代原代细胞进行研究存在潜在的风险性，会使它在细胞治疗、基因治疗等临床应用中受到限制。

四环素诱导表达系统由强启动子、四环素反应元件和四环素类小分子诱导剂构成，其中Tet-On系统的调节蛋白为反义四环素转录激活子，在无诱导物的情况下能持续保持外源基因转录关闭的状态，当存在诱导物时，外源基因转录被激活。Tet-On系统中，不存在诱导物时，反式转录活化因子(rtTA)仍会少量的结合TRE，造成一定的背景表达。

在基因治疗领域，常见的外源基因递送载体有非整合型载体和逆转录病毒载体，但是非整合型载体的转染效率取决于细胞种类及转染试剂，并且只能在细胞核外暂时表达，导致永生化效率偏低。携带永生化因子的逆转录病毒转化的脐带间充质干细胞，能够持续不可控的表达永生化因子TERT，使其在临床应用中有潜在的风险性，会使它在细胞治疗、基因治疗中受到限制。另外，Tet-On 3G系统只有在添加诱导物的情况下，才能诱导表达永生化因子TERT，但是不能将外源基因整合到细胞基因组。

可见，现有技术亟待改进。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法，以克服现有永生化脐带间充质干细胞构建的缺陷，能较好的解决永生化因子TERT连续不可控的表达带来的不安全性。

本发明通过以下技术方案实现的：

一种可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，操作包括：

(S1)借助Tet-on 3G系统构建含永生化因子TERT的可控永生化逆转录病毒载体；