[发明专利]重组H9N2禽流感病毒株、其制备方法、禽流感疫苗及其应用

说明书

本发明公开了一种PB2突变型基因、突变型蛋白、重组载体和重组细胞。本发明还公开了一种重组病毒及其制备方法和应用。本发明还公开了一种H9N2禽流感病毒疫苗及其应用。本发明在H9N2亚型禽流感病毒F/98株的PB2基因上分别引入1185K，R355K氨基酸的突变，可以使F/98株在鸡胚中的复制能力显著增强，病毒复制滴度显著增高，为提高疫苗生产效率，降低生产成本提供了一种有效的技术方法。本发明具有极大的市场应用性和创造出显著的经济效益。

技术领域

本发明属于疫苗生产领域，具体涉及重组H9N2禽流感病毒株、其制备方法、禽流感疫苗及其应用。

背景技术

禽流感是A型流感病毒引起的家禽和野生禽类感染的高度接触性传染病，分为高致病性和低致病性。H9N2亚型属于低致病性流感病毒，可以引起家禽产蛋率严重下降，且容易引起并发感染，造成严重的经济损失。我国自1998年爆发H9N2流感病毒流行，疫苗在该疾病的防控中起到了重要的作用，尤其是禽流感胚毒灭活油乳剂疫苗的免疫效果极其显著。用H9N2亚型禽流感病毒生产的灭活疫苗，对家禽预防H9N2亚型禽流感具有较好的免疫保护效果。但是在生产过程中存在鸡胚早死率和最终死亡率高，平均单胚收获量小，效价不稳定等问题。常规的免疫剂量内不能容纳足够的多种抗原，影响其免疫效力；要使免疫动物获得足量的禽流感病毒抗原，就必须加大注射剂量，从而影响疫苗的应用。疫苗的效果与其抗原量成正相关，要想获得较高的免疫保护率，足够的抗原量必不可少。提高单位体积的抗原含量是生产流感病毒疫苗的关键。禽流感病毒的聚合酶由3个异源三聚体复合物亚基组成，分别是PB2，PB1和PA蛋白。PB2和PB1是碱性蛋白，PA是酸性蛋白。研究显示聚合酶的氨基酸的突变会影响病毒的毒力和复制能力。

RNA病毒的反向遗传操作技术是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，即将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项技术。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补等改造，构建新的病毒株。

目前禽流感疫苗主要为灭活苗，其主要来源于鸡胚扩增。但是在生产过程中存在鸡胚早死率和最终死亡率高，平均单胚收获两小，效价不稳定等问题。要使免疫动物获得足量的禽流感病毒抗原，就必须加大注射剂量，从而影响疫苗的应用。提高单位体积的抗原含量是生产禽流感病毒疫苗的关键。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种PB2突变型基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了重组蛋白、重组载体、重组细胞和重组病毒及其制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是一种H9N2禽流感病毒疫苗及其应用。

技术方案：针对上述问题，为了提高禽流感病毒在鸡胚尿囊液中的滴度，本发明利用反向遗传操作技术，利用1998年中国大陆分离的低致病性禽流感病毒鸡胚高度适应株A/Chciken/Shanghai/F/98(H9N2)的8个基因构建H9N2亚型禽流感病毒F/98株的8个基因的转录/表达质粒，并在其PB2基因上引入点突变I185K或R355K，成功拯救出重组病毒rFPB2-I185K和rFPB2-R355K株，并对其毒力，致病性及免疫效力进行了鉴定。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种PB2突变型基因，其在H9N2禽流感病毒的PB2基因序列的第554位核苷酸由T突变为A，和/或其在第1064位核苷酸由G突变为A。

其中，所述突变后的PB2基因序列其核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：3所示。

本发明内容还包括一种PB2突变型蛋白，其编码所述的PB2突变型基因，所述重组蛋白序列如SEQ ID No：2或SEQ ID No：4所示。