[发明专利]短须库蠓的特异基因及其分子鉴定方法

说明书

本发明涉及昆虫鉴定领域，具体涉及短须库蠓特异基因及其分子鉴定方法。所述特异性基因为CO Ⅰ基因、Cyt b基因中的一种或两种的组合，所述CO Ⅰ基因的序列为SEQ ID NO.1，所述Cyt b基因序列为SEQ ID NO.2，可用于短须库蠓物种的准确鉴定。本发明提供一种准确率高、鉴定时间短的，将CO Ⅰ基因和Cyt b基因结合的短须库蠓分子鉴定方法。将待测的昆虫DNA分别与短须库蠓的CO Ⅰ基因和Cyt b基因同源性比对，当同源性均达到98％以上，则判断为待测的昆虫为短须库蠓。

技术领域

本发明涉及昆虫鉴定领域，具体涉及短须库蠓的特异基因及其分子鉴定方法。

背景技术

库蠓在动物分类上属节肢动物门(Arthropoda)昆虫纲(Insecta)双翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)库蠓属(Culicoides)，是蠓科中最大的一个属，也是吸血蠓属中分布最广，种类最多，与人畜关系最密切的一个属，是多种重要动物虫媒病的传播媒介。近年来，随着全球气候变暖，在一定程度上使库蠓传播虫媒病病毒的能力提高，也使库蠓的分布范围向地球两极和高海拔地区扩大，库蠓种群传播虫媒病毒给动物的能力增强，一些传统的“非媒介”库蠓种类具备了传播疫病的能力。由库蠓传播的虫媒病如蓝舌病、水泡性口炎等，在全球一些国家或地区的传播流行，造成了巨大的经济损失，对畜牧业发展构成了严重威胁。短须库蠓(Culicolides brevipalpis)属库蠓属的二囊亚属，在我国分布于福建、海南、广东、云南、台湾等地。

对吸血蠓的鉴定和识别，是监测与控制蠓传疾病发生的基础，也是疾病预防与控制领域的核心步骤。目前，对吸血蠓的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

随着分子生物学和生物信息学的快速发展，以DNA序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用手段，极大地弥补了传统分类鉴定的不足。线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)具有结构简单，序列和组成一般比较保守，易于操作，母系遗传，单拷贝，进化速率较核DNA快等特点，已被作为分子标记广泛用于昆虫分类学研究中。线粒体基因组中存在的13个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome Oxidase SubunitⅠ，COⅠ)、线粒体细胞色素b(Cyt b)、ND4、ND5这4个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900bp左右这两个条件，但ND4和ND5进化太快，不可能设计出通用引物，限制了它们作为全面DNA鉴定系统的目标基因。由于COⅠ基因在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，而且目前研究表明，其DNA序列本身很少存在插入和缺失(即使有少数也主要分布于该基因的3端，对结果的分析不会造成很大的影响)。同时，它还拥有蛋白编码基因所共有的特征，即密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异，故人们选定COⅠ基因中的一个片段作为DNA条形编码基因。但COⅠ基因作为物种鉴定的唯一目的基因尚存在不足，比如可能会存在杂交或者基因渗透，因此需要尝试多个分子标记的结合使用。

目前，有文献报道尝试将COⅠ和ITS2两个基因作为分子标记对吸血蠓进行鉴定，但ITS变异速度快，种内基因变异大，而且ITS基因序列无法直接测序，只能通过克隆获得，采用其进行组合鉴定在很大程度上影响了鉴定的时效。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供短须库蠓的特异基因，能够用于短须库蠓物种的准确鉴定。

相应地，本发明提供一种准确率高、鉴定时间短的，将COⅠ基因和Cyt b基因结合的短须库蠓分子鉴定方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：