[发明专利]一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法有效
| 申请号： | 201910171366.8 | 申请日： | 2019-03-07 |
| 公开（公告）号： | CN109852587B | 公开（公告）日： | 2021-04-27 |
| 发明（设计）人： | 刘光慧;乔杰;曲静;于洋;王思;耿令令;闵喆莹 | 申请（专利权）人： | 中国科学院动物研究所 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12Q1/02;A61K35/28;A61K35/30;A61P43/00 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 张立娜 |
| 地址： | 100101 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 人科凯恩氏 综合征 特异性 成体 干细胞 制备 方法 | ||
1.一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，包括如下步骤：
(A1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS-iPSC；
(A2)将所述CS-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞；
所述重编程为将OCT3/4基因、SOX2基因、KLF4基因、L-Myc基因和LIN28基因共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞中，并培养至获得所述CS-iPSC；
所述共同导入的方法包括如下步骤：将表达OCT3/4基因的Episomal载体、表达SOX2基因和KLF4基因的Episomal载体和表达L-Myc基因和LIN28基因的Episomal载体共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞；
所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变为c.643GT和/或c.3776CA；
所述成体干细胞为间充质干细胞或神经干细胞。
2.一种经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，包括如下步骤：
(B1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS-iPSC；
(B2)对所述CS-iPSC进行基因编辑，特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变，得到能表达全长ERCC6蛋白的诱导多能干细胞，记为GC-iPSC；
(B3)将所述GC-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞；
所述重编程为将OCT3/4基因、SOX2基因、KLF4基因、L-Myc基因和LIN28基因共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞中，并培养至获得所述CS-iPSC；
所述共同导入的方法包括如下步骤：将表达OCT3/4基因的Episomal载体、表达SOX2基因和KLF4基因的Episomal载体和表达L-Myc基因和LIN28基因的Episomal载体共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞；
所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变为c.643GT和/或c.3776CA；
所述“特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变”为将所述c.643GT矫正为c.643GG，和/或将所述c.3776CA矫正为c.3776CC；
所述(B2)通过如下实现：将gRNA表达质粒、Cas9表达质粒和重组模板共同转入所述CS-iPSC，并培养至获得所述GC-iPSC；所述gRNA表达质粒中的gRNA的识别区域序列为SEQ IDNo.1；所述重组模板为SEQ ID No.2所示的单链寡脱氧核苷酸；
所述成体干细胞为间充质干细胞或神经干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞为皮肤成纤维细胞。
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