[发明专利]一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用

说明书

一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，其可应用于溶栓。本发明通过一系列的酶学性质及体外体内溶栓性质初步研究证明了该酶具有较好的溶栓活性，并借助构建其他动物血栓模型，揭示其体内溶栓机理，借助毒理学试验，发掘其临床应用的安全性，为今后新的治疗血栓药物或者功能性食品的开发提供科学证明及数据支撑。

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

心脑血管疾病是世界上人类死亡的主要原因之一，血管内血栓形成是心脑血管疾病发病的一个主要原因。血管内血栓形成是由于纤维蛋白原在凝血酶作用下转变为纤维蛋白导致的，随后形成不可溶的纤维蛋白结块（凝血反应），这些结块就是血栓的主要组成部分。迄今为止，商业上使用的临床血栓溶解剂如组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂（t-PA）、尿激酶和链激酶，它们有一些不可避免的副作用存在，比如具有出血和堵塞并发症、对纤维蛋白降解的特异性较低、过敏反应及价格昂贵等。

蛹虫草作为一种中国传统的药食两用的珍贵可食用真菌资源，已可被人工大批次生产，被认为是冬虫夏草的理想替代品。蛹虫草中的具有纤溶活性的蛋白酶，作为一种可食用真菌来源的纤维蛋白溶解酶，与其他来源的纤维蛋白溶解酶和现有的治疗血栓的药物相比，具有原料广泛、价格低廉、安全性高、特异性好等优点。但目前对蛹虫草纤维蛋白溶解酶的研究还停留在生物工艺的下游阶段，对纤维蛋白溶解酶的基因研究尚未报道，本发明利用分子生物手段扩增得到编码该纤维蛋白溶解酶的基因序列。对蛹虫草纤维蛋白溶解酶基因进行异源表达，提高产量及酶活。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用，第一次获得了蛹虫草中一种纤维蛋白溶解酶基因，进行克隆后于大肠杆菌BL21中表达，得到蛹虫草纤维蛋白溶解酶的高酶活工程菌，提高表达产量。

本发明的技术方案，本发明对纯化出的蛹虫草纤维蛋白溶解酶进行N端测序并结合质谱测序，鉴定该蛋白为碱性丝氨酸蛋白酶Alp1（NCBI Protein id= EGX91264.1），第一次获得了蛹虫草中一种纤维蛋白溶解酶基因，进行克隆后于大肠杆菌BL21中表达，得到蛹虫草纤维蛋白溶解酶的高酶活工程菌，提高表达产量。

本发明制备的蛹虫草纤维蛋白溶解酶的酶学性质：该酶最适温度60℃，但该放置在室温以上的温度，超过30℃，放置1h酶活开始急剧下降；最适反应pH为7.0-11.0，且在较大pH范围（5.0-11.0）内保持稳定。

低浓度的Fe³⁺对所述蛹虫草纤维蛋白溶解酶酶活具有显著的抑制作用，酶活基本完全丧失，Fe²⁺和Cu²⁺对酶活具有轻微的抑制作用，其余离子如Na⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、K⁺对酶活影响不是特别显著，Ca²⁺和Mn²⁺离子对蛹虫草纤维蛋白溶解酶酶活具有显著的增强作用；丝氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂PMSF、 pepstatin A、EDTA-2Na、leupeptin和TPCK对酶活具有显著的抑制作用，可证明该酶是一个丝氨酸金属蛋白酶，且Ca²⁺和Mn²⁺离子参与酶活性中心的催化。

根据与加热纤维蛋白平板对比，证明蛹虫草纤维蛋白溶解酶溶栓方式为直接降解纤维蛋白，具有较高的纤维蛋白特异性，不具备纤维蛋白原催化活性。该蛋白酶对纤维蛋白原的三条链都具有一定的降解作用，在一定反应时间内，能够使α链含量降解到一定程度，60 min之内就能使β链完全降解，对γ链降解程度次于β链，随着反应时间延长三条链含量越来越少。