[发明专利]一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于描述复合抗原的制备及免疫方法、鸡卵黄抗原的纯化方法及鸡卵黄抗原的稳定性评价方法，包含以下步骤：

1)制备手足口病病毒EV71病毒颗粒；

2)根据EV71序列设计一对特异性引物，以手足口患儿咽拭子标本提取病毒核酸经逆转录后产物cDNA为模板，PCR扩增VP1基因，再经PCR扩增后双酶切的方法构建原核表达载体pET22b-VP1，测序成功后的表达载体用于VP1蛋白的表达；

3)复合抗原的制备；

4)将复合免疫抗原对SPF产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋；

5)将免疫鸡蛋蛋黄进行提取、纯化，后过滤除菌，再经过超低温喷雾干燥，即得抗手足口病的鸡卵黄抗体纯品，4℃保存。

2.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤1)EV71病毒颗粒的制备方法：收集EV71病毒，EV71病毒接种单层Vero细胞，37℃、5％二氧化碳培养至细胞半数死亡，冻融裂解细胞三次后，12000rpm离心收集上清液，甲醛或β-丙内酯灭活病毒，PEG8000沉淀病毒，4℃沉淀过夜，8000rpm离心20min，收集沉淀，PBS缓慢溶解沉淀，再通过蔗糖垫层进行超速离心，病毒颗粒收集完毕。

3.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2)中一对特异性引物的序列，上游引物：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAA，下游引物：AAGAGTAGTGATCGCTGTGCGA。

4.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2)中PCR扩增的VP1，其基因序列为：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTCGGAGAGATAGATCTCCCTCTTGAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCACAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGGAATTGTCCCACAATTGCTCCAATACATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCCAGAGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCTACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCCCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGTGCTTACCAATGGTTTTATGATGGGTATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAGTATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGCACAGCGATCACTACTCTT。

5.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2)中PCR扩增的VP1的反应条件：在95℃条件下反应5min；在95℃下反应30sec；在55℃反应30sec；在72℃下反应90sec，这种95℃、55℃、72℃的方式循环30次；最后在72℃条件下反应10min。