[发明专利]一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物

说明书

本发明涉及一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物、试剂盒以及在单核苷酸多态性检测中的应用。所述发夹修饰引物包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列。本发明提供的发夹修饰引物价格低廉且特异性高，运用通用的荧光引物大大降低成本，所需要的其他实验耗材也廉价易得；一次PCR后进行毛细管电泳，可以直观的看到基因型结果，缩短检测周期，提高检测效率；本发明运用通用型荧光探针，针对不同位点只需要设计发夹引物即可，大大降低研发成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物、试剂盒以及在单核苷酸多态性检测中的应用。

背景技术

作为近年来最有发展潜力的第三代分子标记，单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)在遗传分析中得到了广泛应用。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的80％以上。SNP是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。

目前已经有多种技术检测单核苷酸的多态性，包括一代测序、二代测序、基因芯片技术、等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线等。其中等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)的优势在特异性上尤为突出，但在近几年的实验中发现根据AS-PCR设计出来的引物特异性虽好，但仍有非特异性扩增，即使在引物中引入错配，仍然达不到理想效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，以克服现有AS-PCR技术末端碱基易错配分辨率不高、易产生非特异扩增的缺点。

本发明提供了一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列，所述成发夹序列与引物3’端部分碱基序列互补配对但突变碱基处裸露不互补配对，所述通用荧光引物结合序列与通用荧光引物的上游引物序列相同，所述特异序列用于与模板结合。

进一步的，所述成发夹序列位于发夹修饰引物5’端，长度为9～15个碱基，该引物在自然状态下自身形成发夹结构。所述成发夹序列3’端裸露的单个碱基只与特异的碱基互补配对，引物错配机率大大降低，进一步更准确的区分不同的突变位点。

进一步的，针对同一SNP不同的基因型，一种基因型的通用荧光引物结合序列比另一种基因型的通用荧光引物结合序列长2～4个碱基，且在此区域的3’端一侧长出。通用荧光引物能够与通用荧光引物结合序列的产物互补结合，进行扩增，使产物带有荧光信号，能够进行毛细管电泳。

进一步的，所述特异序列位于发夹修饰引物3’端，长度为10～18个碱基。

进一步的，针对同一SNP不同的基因型，一种基因型的特异序列与另一种基因型的特异序列最后一个碱基不同，引入的错配碱基不同。

进一步的，所述发夹修饰引物对应的下游引物由通用荧光引物下游序列结合区和下游引物依次拼接而成。在PCR时，每一个SNP对应两种发夹引物和一种下游引物，此时，发夹引物形成竞争关系，有利于形成更高的特异性。

进一步的，通用荧光引物的上游引物5’端的碱基带有荧光基团标记。所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、ROX、TaxasRed或CY5，优选FAM、HEX。

本发明中，可针对所有基因型均使用一套通用荧光引物，利用巢式PCR的原理，在前几个循环中，运用发夹引物进行扩增，使产物带有能与通用荧光引物结合的序列，结合后，进行扩增，为目标区域PCR产物加上荧光信号，使其可以在毛细管电泳平台上通过检测荧光信号判断不同基因型。

本发明在进行多重PCR时，不同位点产物片段不同时，多位点仅需共用一套荧光引物便可实现多个位点的检测，大大降低了成本、简化了实验操作，更易推广和使用。