[发明专利]环状RNA快速富集试剂盒及方法

权利要求书

1.环状RNA快速富集试剂盒，其特征在于，包括无核糖核酸酶水、探针杂交缓冲液、探针组及纯化试剂；所述试剂盒配套含有磁力架；其中，所述探针组所包含的探针的序列5’端均经过生物素修饰。

2.如权利要求1所述的环状RNA快速富集试剂盒，其特征在于，所述探针杂交缓冲液为由浓度为100nM的NaCl、浓度为1mM的MgCl₂及浓度为1mM的Tris组成的水溶液，所述探针杂交缓冲液pH为7.5。

3.如权利要求2所述的环状RNA快速富集试剂盒，其特征在于，所述纯化试剂为链酶亲和素磁珠悬浮液及RNA纯化磁珠。

4.如权利要求3所述的环状RNA快速富集试剂盒，其特征在于，所述链酶亲和素磁珠悬浮液为由浓度为100mM的NaCl和浓度为5mM的Tris组成的水溶液，所述链酶亲和素磁珠悬浮液pH为7.0。

5.如权利要求2所述的环状RNA快速富集试剂盒，其特征在于，所述纯化试剂为亲和素磁珠悬浮液及磁珠。

6.如权利要求5所述的环状RNA快速富集试剂盒，其特征在于，所述亲和素磁珠悬浮液为由浓度为100mM的NaCl和浓度为5mM的Tris组成的水溶液，所述亲和素磁珠悬浮液pH为7.0。

7.利用权利要求3或5任一所述的试剂盒快速富集环状RNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、探针杂交

S1.1、将5μg样本RNA溶于无核糖核酸酶水内，得到样品溶液，其中，所述无核糖核酸酶水体积小于20μL；

S1.2、将探针组内生物素标记的各探针溶解后混合，得到探针组溶液；

S1.3、分别将25μL探针杂交缓冲液、步骤S1.1中所得样品溶液、步骤S1.2所得1μL探针组溶液依次加入灭菌离心管中，搅拌混合均匀后通过无核糖核酸酶水定容至50μL，于70℃变性2～5min，快速转移冰浴；

S1.4、将步骤S1.3中所得溶液在37℃孵育10～30分钟得到环状RNA纯化反应体系；

S2、链酶亲和素磁珠清洗

S2.1、向离心管中加入150μL链酶亲和素磁珠悬浮液并放置于磁力架上静置1～2分钟，吸弃上清；

S2.2、将步骤S2.1中所得吸弃上清的链酶亲和素磁珠从磁力架上移开，加入200μL无核糖核酸酶水，震荡均匀，放置于磁力架上静置1～2分钟，吸弃上清；

S2.3、将步骤S2.2中所得吸弃上清的链酶亲和素磁珠悬浮液重复步骤S2.1及步骤S2.2一次；

S2.4、将步骤S2.3中所得吸弃上清的链酶亲和素磁珠在90μL探针杂交缓冲液内重悬浮沉淀，待溶液澄清后吸弃上清；

S2.5、将步骤S2.4中所得吸弃上清的链酶亲和素磁珠悬浮液在50μL探针杂交缓冲液内重悬浮沉淀，待溶液澄清后吸弃上清，放置于37℃水浴中保存；

S3、环状RNA纯化

S3.1、将步骤S1.4中所得环状RNA纯化反应体系加入步骤S2.5中所得链酶亲和素磁珠悬浮液中，低速震荡混匀，37℃孵育5～20分钟，室温静置于磁力架上1～2分钟，将上清液转移至1.5mL离心管内；

S3.2、从冰箱中拿出RNA纯化磁珠，使其温度恢复至室温并搅拌均匀；

S3.3、向步骤S3.1中所得盛有上清液的离心管内加入220μL步骤S3.2所得RNA纯化磁珠，吹打混匀，冰上放置5～15分钟；

S3.4、将经步骤S3.3处理后的离心管放置于磁力架上1～2分钟，待溶液澄清后吸弃上清；

S3.5、将经步骤S3.4处理后的离心管继续放置于磁力架上，加入200μL75％乙醇，吸弃上清；

S3.6、将经步骤S3.5所得吸弃上清的离心管继续放置于磁力架上，加入200μL75％乙醇，吸弃上清；

S3.7、将经步骤S3.6处理后的离心管开盖静置2～5分钟，使磁珠干燥；

S3.8、加入10μL无核糖核酸酶水至经步骤S3.7处理后的离心管内，吹吸混匀10次，静置于磁力架上1～2分钟，转移8μL上清至新的0.2mL离心管中，所得上清液即为纯化富集后的环状RNA。