[发明专利]一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA和带靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CEA的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-MUC1的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CEA的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-MUC1的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR-CEA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CEA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-MUC1包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向MUC1的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；

其中，所述靶向CEA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向CEA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述CAR-CEA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-MUC1的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CAR-CEA和/或CAR-MUC1的编码基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。

6.一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，包括：

(1)分别提供靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA的编码基因和靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因；

所述CAR-CEA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向CEA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-MUC1的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向MUC1的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；

其中，所述靶向CEA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-CEA的编码基因和所述CAR-MUC1的编码基因分别插入到pWPXLd载体中，得到pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒；

(3)分别对所述pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和所述pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒进行包装，得到带CAR-CEA编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-MUC1编码基因的第二重组慢病毒；

(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性抗肿瘤T细胞。

7.如权利要求6所述的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-CEA的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列。

8.如权利要求6所述的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。