[发明专利]一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法

说明书

本发明提供一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，涉及植物基因工程技术领域，本发明所述方法首先构建带有目的基因的发根农杆菌，并使植物的无菌苗生根后进行栽种，当栽种后的无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超3cm且根数多10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得毛状根转基因植物。与常规植物转基因体系相比，本发明的方法可省去植物愈伤细胞再分化步骤，克服利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长等问题。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法。

背景技术

发根农杆菌是一类宿主范围广泛的G-土壤杆菌。农杆菌在侵染植物后，能够诱导植物产生大量高度分支的不定根，通常称为发根。发根农杆菌侵染植物所产生的发根具有生长速度快、分化程度高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点。

基因工程中发根农杆菌侵染形成转基因毛状根是一种快速高效的转基因方法。本研究以同一地域、同一年龄、长势一致的‘Gala’无菌苗为材料，通过农杆菌侵染建立了一种快速高效的苹果转基因体系。发根农杆菌是一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，在植物基因工程中具有广泛的应用，其携带的Ri质粒能有效侵染众多植物，Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞基因组中插入、整合并表达，诱导植物细胞形成转基因毛状根(hairyroot)。由于发根农杆菌转化的毛状根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性。并且，其不仅在形态上植物原根系统的特征得以保存，而且在生理上能够持续合成次生代谢产物，具有原根系统完整的代谢通路。因此，毛状根可作为生物反应器来生产和研究植物的次生代谢物质以及基因的验证。

常规的农杆菌介导转基因主要是利用根癌农杆菌，但是这种转基因植物的构建方法需要大量的时间进行愈伤组织诱导和分化、继代，获得转基因植物的周期较长。

中国专利CN102010877B公开了一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法，以发根农杆菌K599菌液侵染菊花叶片伤口处或叶腋处，直接利用活体植物材料作为受体来诱导不定根，不定根再诱导愈伤组织，分化培养得到完整植株。该方法能够克服假阳性不定根的出现，得到不定根后的诱导愈伤组织以及分化过程无需再使用抗生素杀菌，提高了转基因再生的效率。

中国专利CN101121942B公开了一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其通过发根农杆菌侵染玉米组织，诱导产生毛状根，所得毛状根经分化培养再生，得到转基因植株。该方法的毛状根转化率较高，再生植株移栽成活率高，所得植物表现为根系发达、抗旱性强，可用于生产玉米转基因抗旱植物。

可以看出，现有技术主要是利用发根农杆菌介导得到毛状根，再将毛状根进行诱导分化等，形成新的转基因植株，这些方法获得转基因植株的方法仍然需要进行愈伤组织培养、分化培养、生根培养等步骤，周期较长。

发明内容

本发明为了克服现有转基因植物获得周期较长的缺陷，提供了一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，本发明直接向活植物注射带有目的基因的发根农杆菌，在获得毛状根后本发明直接将植物原有根系去除，快速建立植物的转基因体系。与常规的植物转基因体系相比，本发明所述方法可省去愈伤细胞再分化的步骤，有效缩短转基因植物的构建周期。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，包括以下步骤：

(1)将携带有目的基因的表达载体转化到发根农杆菌中，得到带有目的基因的发根农杆菌；

(2)将植物的无菌苗接种在生根培养基上，培养得到生根的植物无菌苗，栽植；