[发明专利]一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法

权利要求书

1.一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，包括以下步骤：

(1)将携带有目的基因的表达载体转化到发根农杆菌中，得到带有目的基因的发根农杆菌，所述发根农杆菌的种类为MSU440、C58C1或K599；

(2)将植物的无菌苗接种在生根培养基上，培养得到生根的植物无菌苗，栽植，所述植物为苹果Gala、湖北海棠或山荆子；

(3)当植物无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；

所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部0.5～3cm处；

(4)待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超过3cm且根数多于10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得到毛状根转基因植物；

所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的限定。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，生根培养基包括：每升MS液体培养基中含有0.2～1mg IBA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述植物的无菌苗先在继代培养基中培养8～14d后，再接种于生根培养基中；

所述继代培养基包括：每升MS液体培养基中含有0.1～0.6mg IBA、0.1～0.5mg 6-BA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，带有目的基因的发根农杆菌的菌液的OD₆₀₀值为0.2～0.6。

5.根据权利要求1或4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述带有目的基因的发根农杆菌的菌液的制备步骤包括：

S1、将转化后的发根农杆菌接入液体培养基中，26～30℃振荡培养10～16h，得到培养液；

所述液体培养基包括：每升YEP培养基中含有15～25mg利福平和40～60mg卡那霉素；

S2、将培养液接入液体培养基中，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.2～0.6后，离心，取沉淀用MES缓冲液重悬，静置，得到用于注射的带有目的基因的发根农杆菌菌液。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部1～2cm处。

7.根据权利要求1、4或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，注射后的2～3天后在相同位置进行一次再注射。