[发明专利]一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法

说明书

本发明提供一种以维生素D3为底物通过酶转化生产25‑羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：a.发酵：产维生素D3羟化酶的大肠杆菌经IPTG诱导后培养18‑38h；b.破壁：发酵液通过离心收集大肠杆菌，并加入发酵液体积30%‑100%的纯水洗菌体，用磷酸盐缓冲液重悬菌体后通过高压均质机进行破壁处理；c.粗提：将b步骤获得的破壁液离心收集上清液，获得维生素D3羟化酶粗酶液；d.转化：用特定溶剂溶解维生素D3，加入到c步骤获得的粗酶液中，使得维生素D3的终浓度达到0.5‑5g/L，并加入该羟化酶的辅因子，于20‑40℃条件下，转化24‑48h。经HPLC检测，维生素D3的转化率达到80%以上。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种以维生素D3为底物通过游离的维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法。

背景技术

25-羟基维生素D3，又称骨化二醇，是活性维生素D3 类药物的代表之一，于1995年获得美国食品药品管理局（FDA）认证，已载入美国药典USP36-NF31和欧洲药典(EP)8.0。临床上主要用于治疗骨紊乱、代谢性骨疾病等，尤其适合肾功能正常而肝功能丧失不全的患者使用。

目前生产25-羟基维生素D3的常用方法有化学合成法与生物转化法。化学合成25-羟基维生素的方法相当丰富，但路线反应步骤多，往往需要多步的保护与脱保护，分离纯化复杂，收率低，这些因素导致了化学法合成出的25-羟基维生素D3产品价格高昂，难以适应市场需要，且面临原料和试剂成本高、环境污染严重等问题。生物转化法能完成一些化学合成难以进行的反应，具有较强的区域选择性和立体选择性，在温和均一的条件下容易实现自动化和反应的重现性，且能耗低，对环境的污染小。

近年来对微生物催化维生素D3的羟基化研究逐渐热门，构建高效表达维生素D3羟化酶的基因工程菌，以维生素D3为底物进行生物转化获得25-羟基维生素D3是目前生物转化法的主流方向。由于维生素D3羟化酶属于胞内酶，该酶和电子传递链相关的蛋白均位于细胞质或细胞质膜，细胞壁及细胞膜会阻碍底物和产物在细胞内外的交换，羟基化产率较低。因此在发酵液直接转化或者静息全细胞转化时，需加入β-环糊精与表面活性剂等作用于细胞膜、细胞壁和底物的物质以增加转化效率，但是这些物质的引入，势必为后序的提取精制增加负担。因此在目前研究基础上，提高底物转化率、缩短转化周期、精简后提取步骤仍是生物转化法生产25-羟基维生素D3亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有生物转化法的不足，提供一种游离酶转化生产25-羟基维生素D3的技术，将大肠杆菌破壁后获得游离的维生素D3羟化酶，以维生素D3为底物，添加酶转化所需辅因子，使得底物转化率大于80%，转化周期缩短至24-48h。本发明提供的游离酶转化技术能有效的提高转化率、明显缩短转化周期、降低后续提取成本。

具体的， 本发明的目的可通过如下技术措施来实现：

该方法按如下步骤进行：

a.发酵：在发酵培养基（含10-100mg/L氨苄青霉素）中接入大肠杆菌进行培养，初始培养温度为30-40℃，培养至OD₆₀₀=1-5时加入终浓度为0.1-1mM的IPTG作为诱导剂，诱导温度为15-30℃，在转速为200-400rpm的条件下培养18-38h得到大肠杆菌发酵液；

所述发酵培养基主要成分及其含量为: 胰蛋白胨5-20g/L，酵母提取物1-10g/L，NaCl 4-15g/L，pH至7.0；

b.破壁：发酵液通过5000-10000rpm离心1-5min，收集大肠杆菌，并加入发酵液体积30%-100%的纯水洗菌体1-3次，用发酵液体积10-20%的0.2M的磷酸缓冲液（pH7.2）重悬菌体，菌液通过高压均质机在500-1000bar的压力下破壁处理10-40min，使细胞破碎率达到95%以上；