[发明专利]一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法

权利要求书

1.一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入含10-100mg/L氨苄青霉素的发酵培养基中，培养至OD₆₀₀=1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为0.1-1mM，诱导温度为15-30℃，发酵培养18-38h得发酵液；

b.破壁：发酵液通过5000-10000rpm离心1-5min，收集菌体，并加入发酵液体积30%-100%的纯水洗菌体1-3次，用发酵液体积10%-20%的0.2M磷酸缓冲液重悬菌体，其中磷酸缓冲液的pH值为7.2，菌液通过高压均质机进行机械破壁，破壁条件为500-1000bar的压力下处理10-40min，获得细胞破壁液；

c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理1-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶粗酶液；

d.转化：用特定溶剂溶解维生素D3，所述的特定溶剂为乙酸乙酯或乙醇，缓慢加入到c步骤获得的粗酶液中，维生素D3在粗酶液中的终浓度为0.5g/L，同时加入0.01%-0.1%的维生素D3羟化酶的辅因子，在100-500rpm震荡条件下进行游离酶转化，转化温度为20-40℃，转化周期为24-48h。

2.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于a步骤所述的产维生素D3羟化酶的基因工程菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于a步骤所述的发酵培养基主要成分及其含量为: 胰蛋白胨5-20g/L，酵母提取物1-10g/L，NaCl 4-15g/L，pH至7.0。

4.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于d步骤所述的维生素D3羟化酶的辅因子为NADH、NADPH、维生素C、细胞色素C、铜盐和铁盐中的一种。