[发明专利]一种环（异亮-异亮）二肽、其制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种环(异亮‑异亮)二肽、其制备方法以从野生沙棘中分离得到的一株宛氏拟青霉菌SJ1经发酵、分离制得。还提供了环(异亮‑异亮)二肽对作物种子发芽的促进作用、改善作物抗盐性、诱导作物开花、抗黄瓜霜霉病、提升作物抗冻性的应用。该菌株容易培养，用较简单的方法就可以从发酵液中分离提纯得到环二肽类化合物，对环境没有污染，生产周期短，活性超高、生产及使用成本极低，且易于形成大规模批量生产。该类环二肽化合物对作物种子发芽具有明显的促进作用；在抗盐、诱导开花、抗黄瓜霜霉病、抗冻、增产、提高肥料利用率等方面功效显著。具有很好的开发价值，应用前景良好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别为一种环(异亮-异亮)二肽、其制备方法及其应用，具体是从宛氏拟青霉菌中分离纯化制得环(异亮-异亮)二肽的方法，还涉及到该类环二肽化合物在促生、抗盐、诱导开花、抗黄瓜霜霉病、抗冻、增产、提高肥料利用率等方面的应用。

背景技术

环二肽，又称2,5-二酮哌嗪类化合物，是由2个氨基酸通过肽键环合形成的一个稳定的六元环结构，是自然界及天然产物中广泛存在的最小的环肽。迄今为止，众多研究者已从人、其他生物中分离出种类繁多、功能各异的环二肽，并发现其在农药、新型肥料、调节剂的应用方面具有较大的开发潜力。

我国是一个农业大国，长期以来普遍存在盲目、过量施药等不合理的农药施用方式，导致土壤普遍板结和酸化，土壤肥力不断下降，农产品品质不断降低，这些问题已严重阻碍了现代农业产业的健康发展。农作物产量上不去，品质持续降低，这些都是农业生产进入瓶颈期的表现，成为了困扰农业发展和农民增产增收的主要问题。近年来，在供给侧结构性改革的大背景下，农业部开展化肥、农药使用量零增长行动，通过采取物理防控、生态调控、生物防控与精准施药相结合技术，积极推进农药减量控害，促进农药减量增效，取得了明显成效。同时，生物农药、新型肥料等绿色环保产品的开发及研制掀起了传统农药肥料产业更迭浪潮，其中环二肽类化合物研究则是众多研究者的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种环(异亮-异亮)二肽、其制备方法及应用，从野生沙棘中分离得到的一株宛氏拟青霉菌SJ1(该菌株已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.10114)，经发酵、分离得到的天然环二肽，结构鉴定为Cyclo(Ile-Ile)，具有超高活性、功能齐全、绿色环保无污染等特点，应用前景广泛。

本发明提供的一种环(异亮-异亮)二肽，其结构式如下：

本发明提供的一种环(异亮-异亮)二肽的制备方法具体步骤如下：

第一步、宛氏拟青霉菌(Paecilomyces variotii)发酵：

将宛氏拟青霉菌接种于PDA固体培养基中，25℃恒温培养5-7天。将活化好的菌种用打孔器琼脂挖块接种于装有200ml种子培养基(PDA液体培养基)的三角瓶，于25℃，180r/min摇床上振荡培养5天作为一级种液；将一级种液接入5L种子罐中，进行二级种子罐发酵培养；将确定的最适培养液液装于发酵罐中121℃灭菌20min，冷却后接种一级种子，接种量为2-10％，温度24-30℃，初始pH6.8-7.6，搅拌转速140-220r/min，培养5-7天得到发酵液。培养液配方为：马铃薯提取液1.0L，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g；

第二步、发酵液进行离心过滤，得到菌丝体和过滤发酵液；

第三步、将菌丝体洗涤后60℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，用同体积的乙醇浸提24h，浸提3次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡1h，真空抽滤，收集滤液，即为提取液。

第四步、粗提液的制备：将上述提取液用旋蒸仪浓缩后用等体积的含有5％丙酮的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次；然后将上清液用旋转蒸发仪蒸馏得到粗提物，氮吹仪下吹干待用。