[发明专利]一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法

说明书

本发明公开了一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法，该方法包括以下步骤：A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计；A2步骤，srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增；A3步骤，S1与S2片段的克隆；A4步骤，T‑S1和T‑S2的双酶切与纯化；A5步骤，E‑S1与ET‑S2的片段的连接；本发明为srebp1基因的过表达、干扰序列筛选等以srebp1基因CDS区基因序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法。

背景技术

固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regμlatory element binding protein-1c：SREBP-1c)是SREBPs家族中的一员，在人的肝脏、白色脂肪组织等组织中高表达，具有典型的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构域，主要负责激活脂肪酸和甘油三酯的从头合成(Eberle et al.,2004；Muller-Wieland et al.,2012；Shimomura et al.,1997；Wang etal.,1994)，研究表明，SREBP-1c调节的脂肪酸与甘油三酯的从头合成，主要是通过与下游靶基因启动子中的SRE(5’-TCACNCCAC-3’)序列的结合，从而调控靶基因的转录(Shimano,2001)。其靶基因包括脂肪酸合酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)、硬酯酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)在内的负责脂肪酸从头合成的关键限速酶基因、脂肪酸转运的关键蛋白基因等酶(Kim and Spiegelman,1996；Liang et al.,2002；Muller-Wieland et al.,2012；Shao and Espenshade,2012；Xiao and Song,2013)。此外，SREBP-1c还能与PPARγ以及CCAAT增强子结合蛋白家族(CCAAT enhancer bindingproteins，C/EBPs)共同调控脂肪细胞的分化(Kim et al.,1998)。大量研究发现，srebp-1c异常表达导致的脂代谢紊乱与非酒精性脂肪肝、肥胖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等诸多疾病具有显著的相关性，甚至是疾病发生的主要诱因(Shimano and Sato,2017；Tao et al.,2019；Varghese et al.,2018；Wang et al.,2018；Zhang et al.,2017)。

人的srebp-1c基因定位于17号染色体上，其CDS区全长3525nt，编码1174个氨基酸残基，G/C含量为65.3％，PCR扩增得到srebp-1c mRNACDS区全长是对其功能研究的基础，由于其CDS区较长，并且GC含量相对较高，扩增起来具有一定的难度，即使更换多种高保真扩增酶均未成功，然而一些普通酶扩增虽然能够实现扩增，但是连接载体后，经测序发现有碱基的突变，不能使用，因此，使用直接扩增法未能得到有效的srebp1基因序列，很难实现对CDS区全长的一次性扩增。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明通过降低单次扩增长度以提高扩增成功率，应用分段克隆法得到人的srebp1基因编码区(CDS)序列全长，并构建到克隆载体上，为srebp1基因的过表达、干扰序列筛选等以srebp1基因CDS区序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案：

一种人的srebp1基因CDS区分段克隆的方法，包括以下步骤：

A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计；

A2步骤，srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增；

A3步骤，S1与S2片段的克隆；

A4步骤，T-S1和T-S2的双酶切与纯化；