[发明专利]一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法

权利要求书

1.一种人的srebp1基因编码区分段克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计；

A2步骤，srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增；

A3步骤，S1与S2片段的克隆；

A4步骤，T-S1和T-S2的双酶切与纯化；

A5步骤，E-S1与ET-S2的片段的连接；

其中，A1步骤中，从GenBank中下载人srebp1mRNA序列，在CDS区的第2149-2154位为BglII酶切位点，以此酶切位点为分界点，设计分段扩增引物，引物序列如下：

①S1片段引物

S1-R：CAAGGCCCGTGGGAGACTGGTC

②S2片段引物

。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A2步骤包括：

A2.1步骤，HepG2细胞总RNA的提取及反转录：

用TRIZOL方法提取HepG2细胞的总RNA，然后反转成cDNA，反转录的体系与条件为：5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，Toral RNA 1μg，补RNase Free dH₂O至10μl；PCR仪上42℃保温2min，然后向上述反应液中加入PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1μl，RTPrimer Mix 1μl，5×PrimeScript Buffer 2 4μl，RNase Free dH₂O 4μl，共20μl，PCR仪上37℃保温15min，85℃保温5s，待温度降至4℃取出cDNA液-20℃保存备用；

A2.2步骤，S1片段的PCR扩增：

用KOD-Plus-Ver.2试剂盒PCR扩增srebp1基因的S1片段，PCR反应体系为：cDNA 1.2μl，引物S1-F和S1-R各0.6μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgSO₄ 1.2μl，2mM dNTPs 2μl，KOD-Plus-(1U/μl)1μl，补充ddH₂O至20μl；PCR扩增条件为：95℃预变性3min，依次以条件95℃30s，66℃30s，72℃90s进行33个循环反应，然后于72℃10min，取3μl的反应液琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收纯化S1片段，-20℃保存备用；

A2.3步骤，S2片段的PCR扩增：

用KOD-Plus-Ver.2试剂盒PCR扩增srebp1基因的S2片段，PCR反应体系为：cDNA1.2μl，引物S2-F和S2-R各0.6μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgSO₄ 1.2μl，2mM dNTPs 2μl，KOD-Plus-(1U/μl)1μl，补充ddH₂O至20μl；PCR扩增条件为：95℃预变性3min，33个循环反应(95℃30s，65℃30s，72℃90s)，72℃10min，取3μl的反应液琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收纯化S2片段，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A3步骤包括：

A3.1步骤，S1片段的T-A克隆：

取胶回收的S1片段5μl，加入2×Taq PCR Mix 5μl，72℃反应10min，结束后取2μl加入到连接体系中，16℃连接过夜，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄霉素100ng/μl的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用BglII和NotI双酶酶切质粒，电泳检测，并送测序公司测序进一步鉴定，得到S1片段的T-A克隆载体T-S1；

A3.2步骤，S2片段的T-A克隆：

取胶回收的S2片段5μl，加入2×Taq PCR Mix 5μl，72℃反应10min，结束后取2μl加入到连接体系中，16℃连接过夜，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄霉素100ng/μl的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用NotI和XbaI双酶酶切质粒，电泳检测，并送测序公司测序进一步鉴定得到S2片段的T-A克隆载体T-S2。