[发明专利]一种血浆细胞外囊泡长链RNA文库及其构建方法

说明书

本发明公开了一种细胞外囊泡长链RNA文库及其构建方法，该构建方法包括如下步骤：血浆样品分离；血浆细胞外囊泡纯化；细胞外囊泡总RNA提取以及细胞外囊泡RNA测序文库构建和测序分析。本发明的一种血浆细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法可从1ml血浆中稳定获得超过1万个RNA靶点，包括信使RNA、长链非编码RNA和环状RNA，可用于疾病的诊断，尤其是癌症病人的筛查和诊断。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种血浆细胞外囊泡长链RNA 文库及其构建方法。

背景技术

细胞外囊泡是一种由各类细胞分泌的纳米级微囊泡。最初人们认为细胞外囊泡是细胞碎片，因而没有对其进行过多的研究和探索。但近几年有诸多研究表明细胞外囊泡是细胞间信号传递的重要介质，可作为疾病诊断与预后的一种新型生物标记物。细胞外囊泡能成为一种极有潜力的用于诊断或预后的生物标志物，其优势是：存在于较易获得的体液(特别是血液)中，选择性携带了亲代细胞的生物活性物质，具有与亲代细胞相似的生物学活性。细胞外囊泡含有大量的能反映细胞来源的各种生物分子，包括RNA、蛋白质、脂质和代谢物等。阐明细胞外囊泡的分子组成极为重要，这有助于探索细胞外囊泡在细胞通讯过程中发挥的重要作用，有助于挖掘细胞外囊泡作为生物标志物的潜力。但是，目前用于揭示细胞外囊泡内容物的方法还有待开发。

细胞外囊泡中含有大量不同类型的能稳定存在的RNA。关于细胞外囊泡微小RNAs(miRNAs)的研究已较多，能较好地描述其特性，但miRNA数量少，缺乏特异性，限制了其在生物标志物方面的广泛应用。随着研究的发展，越来越多的证据表明长链RNA也存在于细胞外囊泡中，包括信使RNA(mRNA)、环状RNA(circRNA)和长非编码RNA(lncRNA)，可作为疾病诊断标志物，且能发挥一定的生物学作用，具有重要的临床意义。然而，目前尚没有有效的方法对血浆细胞外囊泡中的长链RNA进行高通量的检测和分析。

技术内容

本发明首先提供了一种细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)样品分离

采用两步离心法从全血中分离血浆；

(2)细胞外囊泡纯化

使用膜亲和离心柱子快速分离血浆细胞外囊泡；

(3)细胞外囊泡总RNA提取

使用离心柱子提取细胞外囊泡中的总RNA；

(4)细胞外囊泡长链RNA文库的构建和测序分析

使用SMARTer技术,即Switching Mechanism At the end of RNA Temp 模板末端的转换机制技术制备得到RNA-seq文库；

其中步骤(2)中的膜亲和离心柱子为exoRNeasy血清/血浆试剂盒中的离心柱子；步骤(3)中的离心柱子为miRNeasy试剂盒中的RNeasy MinElute 旋转柱；步骤(4)中的SMARTer技术为SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian试剂盒。

本发明还提供了上述方法构建得到的细胞外囊泡长链RNA文库。

本发明还提供了上述细胞外囊泡长链RNA文库的应用，其可用于癌症的诊断。

其中所述的癌症是肝细胞癌。

具体的说，本发明的一种细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)血浆分离与存储

收集全血，低速离心，收集上层血浆；高速离心血浆，收集上清液。

(2)细胞外囊泡纯化