[发明专利]一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用

权利要求书

1.一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体的构建方法，其特征在于：完全采用甘蓝型油菜基因组来源的抗ALS抑制剂类除草剂基因元件，构建选择报告基因的表达框。

2.根据权利要求1所述的一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法，其特征在于：所述选择报告基因的表达框的启动子、选择报告基因和终止子分别由油菜基因组ALS基因启动子SEQ.ID.NO.1、具有双突变位点的抗ALS抑制类除草剂基因mALS₃基因SEQ.ID.NO.2、以及ALS基因的终止子序列SEQ.ID.NO.3构成。

3.根据权利要求1或2所述的一种含完全植物来源的选择报告基因的植物表达载体构建方法，其特征在于：

1)线性化载体：利用pCAMBIA0390载体序列，设计特异引物0390F(SEQ.ID.NO.4)5-’TGGCGGGATAA CCTAAGAG AAAAGAG-3’，0390R(SEQ.ID.NO.5)5’-CGTTAACACTAGTCAGATCTACCATGG-3’，通过PCR扩增线性化载体，在此过程中缺失掉原载体T-DNA区域内的nos polyA序列，胶回收纯化6.4Kb的PCR产物，用于载体重组反应；

2)含双突变位点的抗除草剂基因mALS₃的克隆：以申请号为201710166233.2的发明专利“基于体外定点突变获得油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因及应用”获得的油菜抗除草剂基因peasy-mALS₃为模板，设计特异性扩增引物，并在上游引物的5’末端增加了同源重组序列，即下化线部分表示增加的碱基序列，以下同，与启动子序列3’末端同源,引物对序列分别为ALSF(SEQ.ID.NO.6)5’-CTCTCTCCTCTAACCA TG GCGGCGGC AA CATCGTCTTCTC-3’和ALSR(SEQ.ID.NO.7)5'-TCAGTACTTAGTGC GACCAT CC-3'；应用北京全式金生物技术有限公司出品的高保真DNA聚合酶试剂盒扩增mALS₃基因序列；胶回收纯化1.9Kb的PCR产物，用于载体重组反应；

3)油菜ALS基因启动子序列克隆:以专利申请号：201710701957.2的发明专利“甘蓝型油菜ALS基因启动子及应用”获得的油菜ALS基因启动子序列为模板设计特异性引物，并在上游引物的5’末端引入与线性化载体左侧末端同源的碱基序列，引物分别为：PrF(SEQ.ID.NO.8)5’-TGACTAGTGTTAACGGTGGAGCTGATCT TACCGACC GAAC-3’和PrR(SEQ.ID.NO.9)5’-GGTTAGAGGAGAGAGAGATGATGAA-3’，应用北京全式金生物技术有限公司出品的高保真DNA聚合酶试剂盒扩增ALS基因启动子序列,胶回收纯化1Kb的PCR产物，用于载体重组反应；

4)油菜ALS基因终止子序列克隆:设计引物序列分别为:AEF(SEQ.ID.NO.10)：5’-ATGGTCGCACTAAGTACTGAGAGATGAA GCTGG TGATCGATCATA-3’和390ER(SEQ.ID.NO.11)5’-TCTCTTAGGTTTACCCGCCATTATTGACACATACACAAA GTGTGA-3’，应用北京全式金生物技术有限公司出品的高保真DNA聚合酶试剂盒扩增ALS基因终止子序列,胶回收纯化500bp的PCR产物，用于载体重组反应；

5)重组法植物表达载体构建：应用诺唯赞生物技术有限公司出品的重组克隆试剂盒Multis，将上述步骤1)、2)、3)和4)各步获得的PCR产物通过重组酶反应构建目标载体，反应体系如下：5×CE Multis buffer 4μl，mALS₃ PCR产物2μl，ALS启动子PCR产物2μl，ALS终止PCR产物2μl，Exnase^TM 2μl，线性化载体4μl,ddH₂O 2μl，于37℃下反应30min，后取5-10μl反应液通过热激法转化感受态大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素的LB培养基上，37℃培养过夜，挑取克隆进行PCR鉴定，再挑取PCR阳性克隆继续液体培养，抽提质粒，用HindIII限制性内切酶进行酶切鉴定，重组后载体含有ALS基因序列，阳性克隆再进一步测序确定后，由此获得的质粒定名为p0390-PdmAP即为含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体，并将目标载体p0390-PdmAP通过电击法转入农杆菌EHA105，PCR鉴定后将阳性克隆培养后于-80℃保存备用。