[发明专利]一种检测靶向基因敲除效果的方法

说明书

本发明涉及一种检测靶向基因敲除编辑效果的方法。其包括如下步骤：处理组：1)构建含有编码靶标蛋白的靶向基因的表达盒的过表达载体；2)构构建靶向基因的敲除编辑载体；3)将所述过表达载体和所述敲除编辑载体共同转入到待编辑的细胞中，得到待检测细胞群；4)通过检测所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量的变化来确定所述敲除编辑载体是否有效。

技术领域

本发明涉及一种检测靶向基因敲除效果的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR associated)系统由两部分组成：介导识别的gRNA(guide RNA)和负责切割的Cas9蛋白。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术应用研究非常广泛。作为一项强大的基因编辑技术，例如基因敲除技术，对构建的CRISPR/Cas9质粒进行敲除效果检测显得尤为重要。一般情况下，将CRISPR/Cas9质粒转入细胞后，若由于基因敲除致使细胞发生大量凋亡，则无法通过流式细胞筛选、单细胞培养或以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增的方式来验证是否产生了碱基的缺失或插入等基因敲除结果。对于基因敲除并不会引起细胞大量凋亡的多数情况下，经过CRISPR/Cas9基因编辑的细胞虽然在经过多次尝试后能够建立稳定的细胞系，但是如果得到的细胞系中存在由于CRISPR/Cas9不能特异性识别靶标片段，而导致没能进行有效的CRISPR/Cas9基因编辑，那么获得的细胞系也是没有任何价值的。于是，细胞建系的过程不仅费时、费力，也不利于研究工作的进行。

发明内容

基于现有技术中存在的问题，发明人也曾尝试通过其他常规手段来加以解决，然而并没有任何进展。例如，以常规的基因敲除处理组与基因未敲除的空白对照组的Westernblot定量比较来进行分析，然而终因难以达到显著性差异而无法判断靶标基因的可敲除性，甚至导致在很多情况下得出所使用的敲除载体不起作用的错误结论。

在经过多种尝试和探索后，确定了本发明的技术方案：构建待敲除的靶向基因的过表达盒，并将该过表达盒同CRISPR/Cas9质粒共同导入细胞，然后通过Western blot等方式来检测待敲除的靶向基因表达蛋白表达量的变化，以此来检测CRISPR/Cas9质粒对细胞中靶向基因的可编辑性。通过这一改进，一方面，对于靶向基因敲除不会引起细胞大量凋亡的多数情况下，省去了建立稳定细胞系后提取基因组的测序过程，因而耗时更少，操作方法更加简单易行。另一方面，对于靶向基因敲除引起细胞大量凋亡的情况，由于无法通过流式细胞筛选、单细胞培养或以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增等现有技术来验证基因编辑效果而显得束手无策。更重要的是，通过本发明的这一巧妙构思使原本通过蛋白定量分析无法检测的方法得以使用，化解了现有技术中存在的各种难题。此外，由于在该方法中可以在过表达盒中加入标签，因此，能够利用标签抗体来间接检测靶向基因表达蛋白表达量的多少进而再确定CRISPR/Cas9系统对靶基因的敲除效果，以达到检测的目的。因此，非常适合那些没有特异性抗体的待敲除的目的基因。与此同时，还可以为后期在活体进行显微注射等操作实验提供可靠的依据。

具体来讲，本发明提供了一种检测靶向基因敲除效果的方法，其包括如下步骤：

处理组：

1)构建含有编码靶标蛋白的靶向基因的表达盒的过表达载体；

2)构建靶向基因的敲除编辑载体；

3)将所述过表达载体和所述敲除编辑载体共同转入到待编辑的细胞中，得到待检测细胞群；

4)通过检测所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量的变化来确定所述敲除编辑载体是否有效。