[发明专利]一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、结核杆菌的培养及结核杆菌菌悬液的制备

BCG菌株及H37Ra株分别接种于罗氏固体培养基中，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长；在生物安全柜内，取培养约2～3周罗氏固体培养基上生长状态良好的BCG菌落，置于已高压灭菌的磨菌器中，分别加少量含0.05％Tween-80的生理盐水至菌株研磨器中，研磨均匀后，使用细菌浊度仪来检测细菌浓度，通过0.05％Tween-80的生理盐水来调整细菌浓度为1×10⁷/ml；标记，-20℃冰箱中保存、备用；

步骤2、BCG菌株原生质体的制备

分别取对数生长期BCG菌液10mL，调整细菌浓度为3.5×107个/mL，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用PBS洗涤两次，加入1ml37℃预热的预处理剂至终浓度为0.01mol/L，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用PBS洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解；水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的BCG菌液加入FDA荧光素染色在荧光显微镜下进行观察原生质体的活性及形成情况；当BCG菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体；

步骤3、H37Ra菌株原生质体的制备

分别取对数生长期H37Ra菌株的菌液10mL，调整细菌浓度为3.5×107个/mL，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用PBS洗涤两次，加入1ml预热的预处理剂至终浓度0.01mol/L，37℃水浴保温20min，3500r/min离心5min，再用PBS洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解；水浴作用过程中，每隔一段时间取少量酶处理的H37Ra菌液加入罗丹明B荧光素染色观察；当H37Ra菌株原生质体的形成率达到90％以上时，离心除酶，再加入原生质体稳定液悬浮原生质体。

2.根据权利要求1所述的新型结核杆菌融合菌株的制备方法，其特征在于，步骤2中，菌体的菌龄为18天、酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为5h。

3.根据权利要求1所述的新型结核杆菌融合菌株的制备方法，其特征在于，步骤3中，菌体的菌龄为21天，酶解浓度为12mg/ml、酶解时间为6h。

4.一种权利要求1所述新型结核杆菌融合菌株的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、融合菌株的制备及鉴定

将制备出具有活性的BCG和H37Ra两亲本菌株原生质体等体积1:1混合均匀，置于电击杯中，在脉冲电压E＝2.2KV/c，脉冲时间t＝8ms时进行电击融合，采用激光共聚焦显微镜观察及鉴定融合子；由于使用FDA荧光染色标记的BCG原生质体显示绿色荧光，罗丹明B荧光染色标记的H37Ra原生质体显示红色荧光，经过电融合后形成的融合子同时带有两种荧光；因此，BCG原生质体与H37Ra原生质体经电融合后，形成的融合子通过激光共聚焦显微镜观察显示黄色荧光；

步骤2、BCG和H37Ra菌株原生质体电融合效率测定

为优化电融合条件，分别以1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4V/cm共六组融合电压进行试验；由激光共聚焦显微镜图片分析软件Zeiss LSM Image Examiner分析可得出，在电压V＝2.2V/cm时融合效率与其他各组比较较高；当电压过高或脉冲强度过强时，均会造成原生质体破损，从而造成融合率的下降，不利于融合子的再生；但若电场强度过小或脉冲强度不够，则双亲菌株的原生质体不能充分接触，不易形成融合子。

5.根据权利要求4所述新型结核杆菌融合菌株的鉴定方法，其特征在于，步骤2中，电融合电压V＝2.2V/cm。

6.权利要求1所述新型结核杆菌融合菌株在新型原生质体疫苗初步筛选过程中的应用。