[发明专利]一种双向表达T载体以及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种双向表达T载体，为两个末端的3’端均具有突出的T的线性质粒，所述双向表达T载体的第一末端设置有第一强启动子和第二终止子，所述第一强启动子的方向朝向所述第一末端的方向，所述第二终止子位于所述第一强启动子的上游；所述双向表达T载体的第二末端设置有第二强启动子和第一终止子，所述第二强启动子的方向朝向所述第二末端的方向，所述第一终止子位于所述第二强启动子的上游。该双向表达T载体同时具有易于TA克隆和高效表达的功能；并且使正、反向连接的外源基因都得到表达；质粒具有基因容量大、转化率高等特点，提高基因的转化效率，适用于高通量基因文库的构建。

技术领域

本发明涉及分子克隆工具领域，更特别的，涉及一种双向表达T载体， 以及其制备方法和应用。

背景技术

随着生物信息学的快速发展，基因组资源日益丰富，越来越多的潜在基 因需要利用体外扩增和克隆技术，深入挖掘其相关结构和功能信息。聚合酶 链式反应(PCR)是体外快速高效获得目的基因的方法，为了直接克隆PCR 产物，T载体被广泛使用，特别当面对大量基因库的克隆工作时，TA克隆是 目前克隆PCR产物最经济、简便的方法。

TA克隆技术采用粘性末端连接的原理，Taq DNA聚合酶扩增时能够在PCR 产物的3’末端加上一个非模板依赖的腺苷酸(dA)，同时T载体带有3’胸 腺核苷酸(dT)突出末端，在T4 DNA连接酶的作用下，可一步快速把PCR 产物插入至载体的多克隆位点中。该方法通过TA黏性末端将载体与基因片 段连接一起，相比平末端连接，连接效率大大提高。

然而，利用传统T载体进行克隆表达时，由于插入DNA片段的方向具有 随机性，无法保证定向克隆；同时经过鉴定获得阳性克隆后，还需要利用特 定的限制性内切酶，经酶切和回收后，亚克隆至相同酶切处理的表达载体中， 再次鉴定获得阳性克隆后，才能用于基因的表达和功能分析，导致克隆过程 繁琐复杂、耗时耗力；此外，目前商业化的T载体多是先使用平端限制性内 切酶(EcoRV)进行线性化后，再利用核酸末端转移酶，以dTTP为底物在3’ 末端各加上一个胸腺嘧啶残基(dT)，经纯化后获得T载体，这种载体的价 格较为昂贵，质量批次不稳定，自身环化率较高，制约了T载体的广泛使用。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种双向表达T载体，为两个末端的3’ 端均具有突出的T的线性质粒，所述双向表达T载体的第一末端设置有第一 强启动子和第二终止子，所述第一强启动子的方向朝向所述第一末端的方 向，所述第二终止子位于所述第一强启动子的上游；

所述双向表达T载体的第二末端设置有第二强启动子和第一终止子，所 述第二强启动子的方向朝向所述第二末端的方向，所述第一终止子位于所述 第二强启动子的上游。

该双向表达T载体具有以下特征：(1)同时具有易于TA克隆和高效表 达的功能；(2)具有双向基因表达元件，使正、反向连接的外源基因都得 到表达；(3)质粒具有基因容量大、转化率高等特点，提高基因的转化效 率，适用于高通量基因文库的构建。

在一个优选实施方案中，所述第一强启动子为T7启动子，所说第一终 止子为T7终止子。T7启动子是IPTG可诱导的强启动子，可在IPTG诱导诱 导下大量表达目的蛋白。

在一个优选实施方案中，所述第二强启动子为热激启动子，所说第二终 止子为热激终止子。热激启动子是热激可诱导的强启动子，可在热激诱导下 大量表达目的蛋白。

通过设置两个可诱导启动子，可根据目的片段的插入方向选择诱导条 件，从而诱导目的基因的大量表达。

在一个优选实施方案中，所述双向表达T载体还包括筛选标记。筛选标 记有助于筛选出接受了该质粒载体的转化子。

在一个优选实施方案中，所述筛选标记为抗性筛选标记。优选为氨苄抗 性基因表达框。

本发明还提供了一种制备上述的双向表达T载体的方法，包括以下步骤：