[发明专利]一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，包括亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液，保护液由以下组分组成：四氢呋喃糠醇80％～85％，D‑α‑生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸10％～15％，乙酸四氢糖酯0.2％～0.3％，乙氧基黄叱精0.05％～0.1％，余量为水。本发明还提供了利用该试剂盒进行游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法。本发明对亚硫酸盐转化方法进行了大幅技术改进，使ctDNA转化能够在温和条件下(70～80℃)条件下快速(40～60分钟)完成，能够稳定体系pH并防止ctDNA降解，能够快速得到高转化率、高质量、高纯度的游离DNA，有利于甲基化研究的全自动化操作。

技术领域

本发明涉及一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，属于基因检测技术领域。

背景技术

表观遗传学研究领域是近几年里众多生物学研究方向中发展最为迅速的一门学科，是经典遗传学的补充和进一步的发展，在人体细胞中被研究的最充分的表观遗传学现象就是DNA的甲基化。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶将甲基基团转移到DNA中的碱基上，脊椎动物中常见的是胞嘧啶，即5-甲基胞嘧啶。哺乳动物中DNA甲基化是必不可少的DNA修饰，几乎所有的甲基化胞嘧啶均发生在CpG位点，CpG岛的胞嘧啶的DNA甲基化在生物过程比如细胞分化和发育中起着重要的作用。另外，异常甲基化是恶性肿瘤的一个标志，并在致癌过程中发挥关键作用，一些DNA甲基化生物标志物已用在肿瘤的预测、诊断和筛选上，所以甲基化是目前肿瘤研究的一个热点。近些年来，以循环肿瘤DNA检测为代表的液体活检技术得到了很好的研究和发展，它可以在很大程度上克服肿瘤组织取材困难，以及肿瘤异质性的问题。目前液体活检的甲基化检测已应用于肿瘤早筛，前景非常广阔。

5-甲基胞嘧啶不能直接通过常规的分子生物学方法检测，因为PCR或者克隆的系统中不包含甲基转移酶，DNA甲基化信息在扩增的过程中丢失。因此，几乎所有的序列特异性的DNA甲基化分析技术在进行PCR或者杂交之前都依赖于DNA亚硫酸盐转化处理。DNA经亚硫酸盐预处理后,重亚硫酸盐对未甲基化的胞胞嘧啶的脱氨基的速度要远高于5-甲基胞嘧啶，非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸盐影响,保持不变。亚硫酸盐将表观遗传学事件转化为基因组的变化,通过区分后者就可间接判断样品中的胞嘧啶甲基化与否。

重亚硫酸盐转化需要苛刻的化学条件才能将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而苛刻的化学条件会导致DNA降解，所以在转化效率、DNA稳定性、操作时间、DNA产量等方面，要想达到一个最佳的平衡，不是一件容易的事情。目前市面上大部分的亚硫酸盐转化试剂盒仍然采用传统的氢氧化钠变性、亚硫酸盐高温转化及脱磺酸基和脱盐。但是长时间的高温低pH处理会导致DNA的严重降解。对于含量极低(不高于1％)、片段极短(平均160bp)且本身极易降解(血液中平均半衰期2h)的循环肿瘤DNA，降解将会更加严重，导致无法进行后续的相关操作，因此目前鲜有能够用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒。

发明内容

针对上述现有技术，基于目前液体活检的甲基化检测火热发展趋势，本发明提供了一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒。本发明对亚硫酸盐转化方法进行了大幅技术改进，使ctDNA转化能够在温和条件下(70～80℃)条件下快速(40～60分钟)完成，转化过程中加入了保护液，能够稳定体系pH并防止ctDNA降解，并采用磁珠法对转化ctDNA进行纯化，能够快速得到高转化率、高质量、高纯度的游离DNA，有利于甲基化研究的全自动化操作，用于后续分子生物学研究，尤其临床分子诊断。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，包括亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液，其中，