[发明专利]磁珠法培养贴壁细胞

说明书

本专利主要描述的是一种新型的贴壁细胞培养方法。这种新型的贴壁细胞培养方法依赖于一种表面经过包被液处理的微型磁珠（50nm），将磁珠和细胞混合于液体培养基中后，细胞将很快贴附于磁珠表面，这样将大大增大细胞的培养面积。同时磁珠具有磁吸附的特性，通过外加磁场可以方便快捷地将磁珠和培养基分离开来，便于细胞的传代和收集。本专利中的贴壁细胞培养方法可以广泛应用于干细胞、成纤维细胞、表皮细胞、DC细胞以及其它贴壁细胞的科研和工业化生产。

技术领域

本专利属于细胞培养领域。

背景技术

1967年VanWeze为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了“微载体”培养系统的新技术概念。微载体是指直径在 60～250μm, 适用于贴壁依赖型细胞在其表面贴壁生长的微珠。由于微载体技术具有一下优点：兼具贴壁细胞培养和悬浮培养的优势，细胞所处环境均一，环境条件（温度、pH值）易监控，具有较高的比表面积，培养操作可规模化、自动化，降低污染的发生。所以微载体技术在大规模工业生产中得到广泛应用。但是制备微载体的材料按其来源可分为两大类 :人工合成聚合物和天然聚合物及其衍生物。按微载体的形态分：固体微载体和液体微载体，目前应用较多时是固体微载体，主要种类有：明胶、胶原、纤维素、甲壳质及衍生物和海藻盐；液体微载体有氟碳化合物液膜微载体。这些不同的微载体各有优势，同时也各自的缺陷，固体微载体后期分离较困难，易变性，不稳定等缺点，液体微载体成本高、制作工艺复杂、部分微载体不能重复利用。微型磁珠是一种直径为50nm-2000nm的超级顺磁性微珠，成分是氧化铁和多糖，表面可标记氨基、羧基、巯基等活性基团。微型磁珠的这些特性决定了它可以以非共价键的形式结合细胞，而且这种结合力可以通过改变pH值和洗脱液的成分来改变这种结合力，实现细胞的结合和分离，同时由于磁珠自身的磁性，在磁场在很容易分离，这种独特的性质决定了微型磁珠可以作为一种新型的微载体应用于贴壁细胞培养。

发明内容

磁珠包被液的配置：配置含500ng/ml 型胶原蛋白和200ng/ml人纤维粘连蛋白的PBS溶液20ml，pH值调至7.6，无菌过滤器过滤除菌备用。

磁珠的包被：将10g无菌的微型磁珠（50nm）加入10mlPBS溶液浸泡30min，离心后倒掉上清，将20ml磁珠包被液加入到10g磁珠中，混匀，37℃包被24h。

细胞的接种：将需要接种的细胞加入适量培养基混匀，然后再加入包被的微型磁珠，取样在显微镜下观察细胞和磁珠的比例，一般在2:1左右即可，转入培养容器中培养搅拌培养，根据细胞种类设置培养条件。

细胞的传代：当磁珠表面细胞融合度达到80%时，收集细胞液，在外加磁场的作用或者用磁力吸附架下，富集磁珠，去掉培养基，加入与磁珠等体积的0.25%胰酶，消化1分钟，加入2倍磁珠体积终止液（小牛血清），将消化液加入到带磁场的过滤柱中，再加入3倍体积洗脱液（pH值7.6的PBS）进行洗脱，将洗脱液进行1200rpm离心8分钟，得到细胞沉淀，消化后的磁珠可进行再次复性，重复利用。加入适量培养将细胞重悬，然后再加入适量微型磁珠（50nm），取样在显微镜下观察细胞和磁珠的比例，一般在2:1左右即可，转入培养容器中培养搅拌培养，根据细胞种类设置培养条件。

细胞的收集纯化：收集细胞液，在外加磁场的作用或者用磁力吸附架下，富集磁珠，去掉培养基，加入与磁珠等体积的0.25%胰酶，消化1分钟，加入2倍磁珠体积终止液（小牛血清），将消化液加入到带磁场的过滤柱中，再加入3倍体积洗脱液进行洗脱，将洗脱液进行1200rpm离心8分钟，得到细胞沉淀，注意观察离心管底部是否有残留的磁珠，如果含有残留磁珠，加入5倍体积生理盐水重悬细胞，再次加入到磁场的过滤柱中，加入3倍体积洗脱液进行洗脱，将洗脱液进行1200rpm离心8分钟，再次得到细胞沉淀。确认底部没有残留磁珠后方可将收集的细胞留存或者另做它用。