[发明专利]RNA纯化试剂盒及富集miRNA的方法

说明书

本申请涉及一种RNA纯化试剂盒，包括酸处理玻璃粉和悬浮溶液，该酸处理玻璃粉具有325目或更细的粒度，该悬浮溶液以超纯水为溶质，包含0.2‑1M的离液盐和0.05‑0.2M的缓冲剂，pH 5‑7。本申请还涉及一种从含有总RNA的水溶液中富集miRNA的方法，包括使用本发明RNA纯化试剂盒中的酸处理玻璃粉和悬浮溶液配成的RNA纯化试剂处理含有总RNA的水溶液，经后续处理而从总RNA富集miRNA。本申请的RNA纯化试剂盒和miRNA富集方法成本低，操作相对简单，miRNA提取纯度高，提取损失小，减少后续高通量建库测序过程中的试剂和数据浪费，尤其适用于血浆或血清miRNA的提取纯化和选择性富集。

技术领域

本发明涉及生化纯化技术领域，具体涉及一种RNA纯化试剂盒及一种富集miRNA的方法。

背景技术

miRNA(MicroRNA)是一类非编码单链小RNA，一般由18-23个核苷酸组成。作为微型调节分子，miRNA通过与信使RNA(mRNA)的3’-UTR区域特异结合，抑制蛋白翻译或者直接导致mRNA降解，在转录后水平调控蛋白质的表达。miRNA参与细胞的增殖、分化、凋亡等各类重大的生化过程，在人体中的表现就是在一些重大疾病如心血管疾病、肿瘤的发生发展过程中发挥调控功能。研究发现，成熟的miRNA能够稳定存在于血浆或血清中，可以为心血管疾病等的诊断和预后提供重要线索。

为了检测血浆或血清中miRNA的表达水平，首先需要从血浆或血清样本中提取得到纯度高、总量足的miRNA。目前常见的血浆或血清RNA提取方法主要分为两类，一类是专门的提取试剂盒，如QIAGEN的QIAampCircuLating NucleicAcidKit、Thermo的mirVana^TMPARIS^TMKit等，另一类是常规的总RNA提取试剂，如Thermo的TrizolLS、TrizolReagent等。

QIAGEN的QIAampCircuLatingNucleicAcidKit主要采用硅酸盐基质膜吸附的方式，对血浆或血清中的RNA进行富集。血浆或血清样本经过裂解液处理后，通过离心将核酸特异性的结合到QIAamp离心柱上，并通过后续的清洗步骤，将样品中的蛋白质、PCR抑制物、污染物等去除，最后经过洗脱，获得纯化的核酸样品。同时，可以结合试剂盒配套的RNase-FreeDNaseSet进行DNA的柱上消化，确保获得的核酸样品中无DNA污染。

Thermo的mirVana^TMPARIS^TMKit分离试剂盒采用玻璃纤维吸附的方法，可以从组织、细胞及血浆和血清中分离各种类型RNA，如总RNA、mRNA、miRNA、小分子干扰RNA(siRNA)和核内小分子RNA(snRNA)等。此试剂盒采用有机溶剂提取技术，并利用特制的结合溶液与洗涤溶液进行玻璃纤维滤膜纯化，从而获得高纯度的RNA样品。

Thermo的TrizolLS和TrizolReagent属于常规的RNA提取试剂，主要成分苯酚是组织或细胞裂解剂，也含有8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等RNA酶(RNase)抑制剂。Trizol提取过程中，利用酸性的水相环境获得高纯度的RNA水溶液，并通过氯仿抽提的过程去除DNA、蛋白质等杂质，最后使用乙醇或异丙醇醇沉，获得总RNA样品。

目前现有的技术中，专门用于血浆或血清RNA提取的试剂盒价格昂贵，虽然能够获得纯度较高的血浆或血清RNA产物，但往往步骤繁琐，得率较低，且无RNA类型或片段长度的特异性。另外，基于滤膜吸附过滤的富集方法，往往受限于膜的制作工艺，造成片段长度较小的RNA在离心过程中的丢失，不利于miRNA的检测。在后续的检测过程中，无长度特异性的提取产物中非miRNA的其他类型RNA往往会占用较多的试剂和数据资源，导致成本的进一步升高。常规的RNA提取试剂如Thermo的Trizol LS和Trizol Reagent，价格较为便宜，一般得率也较高，但是对于污染物的除去效果较差，同时也无法仅通过提取流程区分不同类型、不同片段长度的RNA。

发明内容