[发明专利]一种基于抑制细菌毒力释放的降低抗生素用量的方法与应用

说明书

本发明涉及一种基于抑制细菌毒力释放的降低抗生素用量的方法与应用。一种QQAM蛋白与抗生素联用生产的药物在杀灭产生物被膜的致病菌中的应用，所述QQAM蛋白选自：(i)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白。本发明首次发现通过QQAM蛋白与抗生素联用进行杀灭产生物被膜的致病菌时，使得抗生素更加容易进入致病菌体内，从而实现少量抗生素起到抑制致病菌的效果，且该效果显著优于现有已知的其他类似作用机制的蛋白，更为惊奇的是，本发明所述的QQAM蛋白与抗生素联用时，会显著降低相关致病菌的抗生素抗性，这完全出乎了本领域技术人员的预料。

技术领域

本发明涉及一种基于抑制细菌毒力释放的降低抗生素用量的方法与应用，属于蛋白质工程技术领域。

背景技术

不同微生物物种间普遍存在有一种交流方式，它为群体间的沟通架起了桥梁，并对微生物的正常生理代谢过程有着举足轻重的影响，这类交流方式称为群体感应或密度感应(quorum sensing,QS)。具体指微生物会向其所在微环境中分泌某些化学信号因子，通过对其的监测来完成相关基因表达的调控，进而改变微生物的生理代谢功能。QSA(由AHL诱导的QS)是一种微生物通讯机制，可调节基因表达并协调微生物群体行为，首先在几种细菌物种中被鉴定，其中大多数是病原菌。一系列研究表明，多种病原菌分泌的致病因子与QSA密切相关。

通过群体感应淬灭(QQ)干扰QSA系统代表了治疗细菌性疾病的新的策略。从理论上讲，QQ可以降低QSA控制下任何病原体产生的毒力因子的表达。AHL信号分子的降解是阻断QSA过程的主要方式之一。在之前的研究中，发现了一种新的QQ酶MomL(QQAM)，可以降解普遍存在的信号分子AHL。QQAM是从海洋耐油具柄菌Muricauda olearia Th120中鉴定出来的，属于金属-β-内酰胺酶家族，与粘着杆菌Tenacibaculum sp.中的Aii20J蛋白具有最高的同一性。此外，QQAM与AiiA具有24.5％的同一性，AiiA是芽孢杆菌Bacillus sp.240B1中首次发现的，是研究最充分的AHL内酯酶。体外试验证明了QQAM抑制病原体中的致病因子表达的能力。酶动力学实验表明，QQAM具有较高的中链和长链AHL降解活性水平。C6-HSL的降解效率k_cat/K_M值达到2.9×10⁵s^-1M^-1，并且降解能力随着信号分子链长的增加而增加；例如，3OC10-HSL的k_cat/K_M为5.1×10⁵s^-1M^-1。这种广泛的底物选择性可能赋予QQAM普遍抑制QSA依赖性病原体毒力的能力。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种条件致病菌，其很容易感染免疫衰弱和免疫缺陷的病人，是医院内感染的主要菌株之一。临床上，它极易引起术后的皮肤、皮下组织、软组织、骨、耳、眼、尿路、呼吸系统和心脏瓣膜等感染，是人类的三大致病菌之一。同时，它也是引起肺炎的首要致病菌。铜绿假单胞菌感染之后，由于其主动泵出系统、生物被膜、外膜通透性降低和细菌改变抗菌药物作用的靶位等多重耐药机制，耐药率高，能够迅速逃避和耐受抗菌药物的抗菌作用，在临床上经常会引起顽固的难以治愈的感染，成为了目前临床治疗的棘手问题。

生物被膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。多糖基质通常是指多糖蛋白复合物，也包括由周边沉淀的有机物和无机物等。细菌生物被膜是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象,由微生物及其分泌物积聚而形成。具有生物被膜的微生物比没有的单细胞微生物具有更强的环境适应性，它的形成给人类带来了严重的危害。如在医药领域，据研究表明，约65％的人类细菌性感染疾病与生物被膜有关，生物被膜包裹的细菌对几乎所有的抗生素均表现出极强的抵抗力，可逃避宿主的免疫反应，从而引起难以治愈的慢性感染。生物被膜中微生物对抗生素的耐药性比浮游状态时高成百上千倍，大大增加了临床治疗的难度。