[发明专利]采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法

权利要求书

1.采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

A、培养微藻

在灭菌后改良的GPY培养基中采用异养培养的方法培养微藻制成发酵液，接种量为每升培养基接种微藻0.05克-0.2克，在装液量体积比为30%-50%、培养温度为23℃-28℃、转速为150转/分钟-250转/分钟的条件下培养5天-8天；所述的微藻选自破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻；

B、酶解破壁微藻

将步骤A中获得的发酵液高速离心后获得湿微藻藻体，按照每克藻体干重加入5毫升-20毫升蒸馏水以及0.01%-1%碱性蛋白酶的比例在湿微藻藻体中加入蒸馏水及碱性蛋白酶进行酶解，将酶解后的物料高速离心后获得破壁的微藻；

C、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA

按照每克已破壁的微藻干重加入3毫升-5毫升的乙醇和20微升-60微升的液体脂肪酶A的比例，在步骤B中获得的破壁的湿微藻中加入乙醇及液体脂肪酶A进行转酯化反应，获得低值的生物柴油和高值化的DHA，转酯化反应的条件是：温度为30℃-40℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，时间为60小时-96小时；液体脂肪酶A的选用南极假丝酵母脂肪酶A；

D、富含DHA藻油和生物柴油的分离

将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入正己烷，充分萃取后分离正己烷相并去除萃取剂，得到粗生物柴油；

下层乙醇相高速离心收集乙醇，藻渣采用乙醇充分萃取，合并萃取液并去除乙醇得到富含DHA的藻油；

所述的步骤A中的微藻选自破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148、裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381、裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC28209和寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340中的一种；

所述的步骤B中的酶解条件是：温度为35℃-55℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，酶解时间为4小时-24小时。

2.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤A中每升改良的GPY培养基包含如下质量的原料：

海盐15克-30克；葡萄糖5克-20克；蛋白胨3克-10克；酵母膏1克-10克。

3.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤B中高速离心的条件是：转速为3000转/分钟-6000转/分钟，时间为3分钟-10分钟。

4.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤B中的碱性蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis发酵获得，由山东佛森生物有限公司生产，商品名碱性蛋白酶，酶活为20万U/g。

5.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤C中南极假丝酵母脂肪酶A由丹麦诺维信公司生产，英文缩写CALA，商品名NovoCor®ADL，酶活6KLU/g。

6.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤D中采用正己烷萃取得到粗生物柴油的具体工艺步骤为：将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入6-10倍体积的正己烷，充分萃取后静止分层，收集上层正己烷相；在下层中再加入6-10倍体积的正己烷，萃取并静止分层，收集上层正己烷相，将两次的正己烷相旋转蒸发去除正己烷获得粗生物柴油。

7.根据权利要求1或6中任一项所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤D中富含DHA的藻油的分离具体工艺步骤为：下层乙醇相在转速为3000转/分钟-6000转/分钟的条件下离心3分钟-5分钟，收集乙醇溶液；藻渣用同等体积的无水乙醇，洗涤两次，在转速为3000转/分钟-6000转/分钟的条件下离心3分钟-5分钟，收集乙醇溶液，合并乙醇溶液旋转蒸发去除乙醇，获得富含DHA的藻油。