[发明专利]新型细菌lpp突变体及其在重组蛋白质的分泌生产中的用途

说明书

本发明涉及一种细菌菌株，其含有至少一种编码重组蛋白质的基因，其特征在于其含有由以下组成的开放阅读框：(i)编码介导所述蛋白质向周质的易位的N‑末端信号肽的DNA片段，其连接至(ii)编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及(iii)编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。本发明还涉及一种用于使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白质的方法。如此，可能实现与现有技术相比培养基中的重组蛋白的增加的量。

本发明涉及一种新型细菌lpp突变体及其在分泌生产重组蛋白质的发酵方法中的用途。

近年来，重组蛋白质药物(药物蛋白质/生物制品)的市场增长强劲。特别重要的蛋白质药物为真核生物蛋白质，特别是哺乳动物蛋白质和人蛋白质。重要的药物蛋白质(药物活性蛋白质)的实例为细胞因子、生长因子、蛋白质激酶、蛋白质和肽激素以及抗体和抗体片段。由于药物蛋白质的生产成本仍然很高，因此一直在寻求更有效并因此更具成本效益的方法和其生产系统。

通常，重组蛋白质在哺乳动物细胞培养物或在微生物体系中产生。与哺乳动物细胞培养物相比，微生物体系的优势在于，以这种方式可在更短的时间内以更低的成本生产重组蛋白质。因此，细菌特别适合于重组蛋白质的生产。由于其广泛研究的遗传学和生理学、较短的传代时间和简单的操作，革兰氏阴性细菌肠杆菌(Escherichia coli)目前是生产重组蛋白质最常用的生物。特别有吸引力的是这样的生产方法，其中靶蛋白质被细菌细胞以正确折叠直接释放到发酵培养基中，因为这免去了复杂的细胞破裂和可能的无益的蛋白质重折叠过程。细胞外生产的另一优势为，由于靶蛋白质的积累不受周质或细胞质空间的限制，将靶蛋白质释放到培养基中通常可以提高产物产量。

适用于细胞外生产靶蛋白质的是，例如，所谓的大肠杆菌的“渗漏(leaky)”菌株，由于细胞包膜的某些结构元件的缺失或改变，其将位于周质中的蛋白质排放到培养基中的程度增加。这种“渗漏”菌株的外膜中脂蛋白的比例可能改变，尤其是某些Braun的质脂蛋白(lpp)的突变体中(Inouye等，1977,J.Bact.132,308-313页；Suzuki 1978,Mol.Gen.Genet.167,1-9页；Giam等，1984,Eur.J.Biochem.141,331-379页)。

已经公开了异源蛋白质的工业规模生产方法，其中使用大肠杆菌的不同lpp突变体来实现将靶蛋白质释放到发酵培养基中(US 2008/0254511 A1，US 5,223,482 A)。

但是，由于细胞裂解的趋势较高，“渗漏”菌株在某些异源靶蛋白质的生产中具有以下缺点：尽管采取了某些稳定细胞的措施例如，向培养基中添加增加量的Ca和Mg离子(见US 2008/0254511 A1)，它们仍相对较早且强烈地发生裂解，结果是，首先，缩短了蛋白质的生产阶段并因此产物收率低于其在较长的生产阶段的情况中的可能收率。以及其次，细胞裂解导致培养基粘度升高，这尤其可归因于细胞裂解时释放的DNA。结果，靶蛋白质的后续纯化和回收变得更困难，且这又导致不必要的高处理成本。

本发明的目的为提供一种用于生产重组靶蛋白质的发酵方法中使用的突变的细菌菌株，其中靶蛋白质的主要部分在培养过程中被分泌到发酵培养基中，并且存在于培养基中的靶蛋白质的量高于现有技术中公开的细菌菌株的情况，即，靶蛋白质将以增加的产量存在于培养基中。

该目的通过含有至少一种编码重组蛋白质的基因的细菌菌株实现，其特征在于：

所述细菌菌株含有由以下组成的开放阅读框：

I编码介导所述蛋白质向周质的易位的N-末端信号肽的DNA片段，其连接至

ii编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及