[发明专利]使用耳垢测定皮质醇和葡萄糖平均浓度的方法

权利要求书

1.一种测量耳垢中葡萄糖和皮质醇水平的方法，包括以下步骤：

通过任何合适的方法从耳朵中提取耳垢样本；

按照测量方法准备耳垢样本以测量皮质醇和葡萄糖水平；

使用任何已知的手段或方法测量皮质醇和葡萄糖，其中将皮质醇和葡萄糖的水平解释为平均皮质醇和葡萄糖水平。

2.根据申明1所述的测量葡萄糖和皮质醇水平的方法，其中：

使用Reiner-Alexander注射器从外耳中提取耳垢。

样本的制备通过以下方式进行：

a)干燥耳垢样本，直到所有水分从样本中蒸发为止。该步骤也可以使用冻干来完成。

b)称量干燥耳垢样本的重量，以通过干重来标准化皮质醇的量。归一化是指将测得的重量调整到标准比例，以便能够比较数据；

c)用1ml磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)使干燥后的样本均质化，获得耳垢的PBS溶液。磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液的体积可以是耳垢10重量的10倍，例如，100g的耳垢使用1000ul的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液。此外，可以使用任何亲水性溶剂，例如生理盐水。

d)将步骤c)中获得的溶液分为第一溶液部分和第二溶液部分，并将每个溶液部分分别添加到试管中；

e)在PBS和第一溶液部分之间以1∶1的比例向第一溶液部分中添加溶剂，以获得耳垢在PBS与溶剂中的混合溶液；

f)在至少一分钟内搅拌装有步骤e)获得的溶液的试管，以使其充分混合，并在重悬后加入0.5mg的二乙醚，与PBS的比例为1∶1；

g)在至少两个小时内，将步骤g)中获得的混合溶液在-18至-21℃(最好在-20℃)的温度下冷却，以确保液体部分被冷冻并且不污染有机部分。该步骤可以提取那些明确溶解在二乙醚中的化合物，例如皮质醇。采取该步骤是因为尽管二乙醚部分在-20℃下可以保持液态，但磷酸盐部分却被冻结了；

h)从冷却的溶液中提取明确溶于二乙醚的化合物；

i)干燥剩余的液体溶液；

j)将步骤i)中得到的干燥部分储存在-80℃下以备进一步使用；

k)向第二溶液部分中加入300pg皮质醇，以得到耳垢与皮质醇混合后在PBS中的溶液；

l)向步骤k)获得的溶液中加入0.5ml溶剂，以定量纯化的皮质醇的量；

m)在至少一分钟内搅拌装有步骤l)所得溶液的试管，获得的溶液在重悬后向其加入0.5mg乙醚，与PBS的比例为1∶1；

n)在至少两个小时内，将步骤m)获得的混合溶液在-18至-21℃(最好在-20℃)的温度下冷却，确保液体部分被冷冻，并且不会污染有机部分；

o)从冷却的溶液中萃取明确溶于二乙醚的化合物；

p)干燥剩余的液体溶液；

q)将步骤i)中获得的干燥部分储存在-20至-90℃之间的温度下以供进一步使用；

r)将0.5ml 300pg/ml的纯化皮质醇溶液在pH介于6.8和7.2之间的PBS中溶解。进行此步骤为了提升皮质醇耳垢提取方案的效率。

s)对第二溶液部分进行与第一溶液部分相同的程序以从中提取皮质醇。

皮质醇的测量通过以下方法进行：

a)使用制造商提供的缓冲液分析法对提取的样本进行重构，该方法使用比色竞争ELISA技术，通过向提取的样本中添加缓冲液以获得溶液，通过将其静置并搅拌来对皮质醇进行定量。

b)使用测量皮质醇的标准曲线-酶标仪(NovoStar)来测量样本中皮质醇的总量；

c)使用荧光技术将耳垢的干重归一化，其中荧光计在530-570nm范围内激发，在590-600nm发射范围内读数。由于年龄，性别，不同的医疗状况和压力水平等多个变量可能会影响耳垢中皮质醇的水平，而胆固醇水平不受上述变量的影响，因此使用胆固醇水平以避免这些协变量使皮质醇的结果混淆，并且遵循制造商的说明，使用Kit SERA-PAK PLUS(BayerHealthCare)对溶解的耳垢溶液中的葡萄糖含量进行测量，其中葡萄糖吸收量在505nm处一式三份进行定量。使用其吸收平均值获得葡萄糖浓度(mg/dl)。根据标准化过程后样本的初始重量，计算溶液中的葡萄糖总量。

3.根据申明2所述的葡萄糖和皮质醇水平的测量方法，在步骤a)中，使用N₂蒸汽在环境温度下干燥耳垢。