[发明专利]用于根器官培养物的生物反应器

说明书

本发明涉及用于根器官培养物的生物反应器，其使得能够在无菌环境之外进行大部分接种或生物量转移、培养物的培养和收获。本发明进一步涉及生产和无菌收获根的方法，以及单独或作为还包括接种容器或至少一个另外的生物反应器的装置的部分使用上述生物反应器生产根培养物的方法。

发明领域

本发明涉及用于根器官培养物的生物反应器，其使得能够在无菌环境之外进行大部分接种或生物量转移、培养物的培养和收获。本发明进一步涉及生产和无菌收获根的方法，以及单独或作为还包括接种容器或至少一个另外的生物反应器的装置的部分使用上述生物反应器生产根培养物的方法。

发明背景

根器官培养物的生产提供了获取植物组织衍生化合物的途径，而避免了从田间起源植物衍生化合物的常见弊端。在生物反应器中，所有环境因素都可以在窄的范围内控制。该益处允许灵活、可再现且可预测的生物量收获以衍生经济上相关的化合物，例如次生植物代谢物。根器官培养物通常不依赖于光合作用，并从培养基中隔离所有必需的营养物。然而，根器官培养物可分为发根和不定根。

发根(hairy root)来源于用发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化的植物材料。转化后，植物组织在细根中生长，没有进一步分化成不同的组织类型。可以使用发根培养物，利用其一系列代谢途径或植物来源，在液体培养物中产生高价值的次生植物代谢物。代谢物和其他有价值的产物包括染料、调味剂、农药和药物。根器官培养物通常是遗传稳定的长期培养物，并且发根培养物是特别有利的，这是由于发根表现出的快速生长通常与悬浮的非植物真核细胞培养物的生长速率相当。重要的是，与这些其他悬浮培养物相反，发根培养物不需要对培养物添加生长调节因子。

然而，由于这些根的形态，大规模的发根培养存在一些问题。具体来说，发根具有正常植物根的主要形态特征，这意味着它们适合于在固体培养基上生长。因此，它们在液体培养物中生长时相互附着，并在液体培养基中伸长生长时形成致密的团。由于这些根团，在接种(生物反应器生产过程的第一步)过程中就已经出现处理发根培养物的困难。

原核或其他真核生物体的细胞悬浮培养物可以容易地在容器之间转移以进行接种，其中通过管和导管在容器或容器室之间的转移几乎不依赖于各自的生物量浓度。相反，随着培养物生物量持续生长，发根团的大小增加。因此，就接种管、管和端口而言，用于接种较大培养物的接种物中较高的生物量浓度影响合适的接种容器和生物反应器的技术设计方面。因此，从实验室到工业规模的培养规模扩大，生长形态极大限制了基于发根的生产过程的技术装置的设计空间。

到目前为止，这些挑战仅得到部分解决。实验室规模的发根培养物中使用的标准程序是手动解剖根团，随后将所得的根块手动转移至生物反应器。因此，接种容器和生物反应器通常在无菌环境，例如层流工作台中开放以在不污染培养物的情况下手动转移根块。然而，这种方法很难放大到工业生产体积。

Ramakrishnan et al.(1994,Biotechnology techniques 8(9):639-644)进行了向用发根培养物接种生物反应器的可放大解决方案的第一步。他们使用灭菌的搅拌器将预培养物的根匀浆化以制备接种物。然后将得到的浆液过滤，吸干并通过4L转移容器通过使用压缩空气的正置换转移到16.68L生物反应器中。然而，切割、过滤、吸干和填充转移容器的步骤都必须在无菌环境中进行，这与手动转移一样限制这种方法的可缩放性。

Wilson et al.(1990,Progress in Plant Cellular and Molecular Biology,pp.700-705；and WO 89/10958)能够使用与500L生物反应器顶部以凸缘连接的专用接种容器来接种500L中试规模生物反应器。然而，该较小的接种容器的接种也必须在无菌环境中进行，也在无菌环境中解剖根块。除此之外，从500L扩大到工业规模培养体积的问题仍然难以捉摸，并且尚未报告针对反应器接种目的的发根培养接种或转移的可缩放解决方案。