[发明专利]N-乙酰神经氨酸的发酵生产

权利要求书

1.一种非天然存在的微生物，其能够产生Neu5Ac，其中所述非天然存在的微生物具有包括至少一种异源酶的唾液酸生物合成途径，其中所述微生物的天然存在的唾液酸分解代谢途径已被失效，其中至少一种用于输入在发酵生产Neu5Ac期间不用作碳源的糖的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统已被失效，其中所述微生物可以利用发酵液中存在的外源碳源作为唯一的碳源，而不使用磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统来获取所述外源碳源。

2.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述唾液酸生物合成途径包括谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶、葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶、N-乙酰神经氨酸合酶和类HAD超家族的糖磷酸酶。

3.根据权利要求1或2所述的非天然存在的微生物，其中所述唾液酸生物合成途径的至少一种酶为异源酶。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的非天然存在的微生物，其中天然存在的唾液酸分解代谢途径已被失效。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然存在的微生物，其中一种或多种编码参与唾液酸分解途代谢径的酶的基因被从非天然存在微生物的基因组中缺失，其中一种或多种编码参与唾液酸分解代谢途径的酶的基因的表达被削弱，或者其中至少一种编码参与唾液酸分解代谢途径的酶的基因的蛋白质编码区的核苷酸序列被改变，使得由所述改变的蛋白质编码核苷酸序列编码的多肽不具有由未改变的核苷酸序列编码的酶的酶活性。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物已被遗传工程化，以缺失一个或多个选自以下的基因：编码N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶和唾液酸通透酶的基因，其中这些基因中一个或多个的表达被削弱，或者其中这些基因中至少一个的蛋白质编码区的核苷酸序列被改变，使得由所述改变的核苷酸序列编码的多肽不具有由未改变的核苷酸序列编码的酶的酶活性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的非天然存在的微生物，其中一种或多种选自N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶和N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶的活性已被消除。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物已被遗传工程化，以通过以下方式消除N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶和/或N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的活性：通过缺失一个或两个编码这些酶的基因，通过削弱这些基因中一个或两个的表达，或通过突变一个或两个基因的蛋白质编码区，使得由每个改变的核苷酸序列编码的多肽不具有由未改变的核苷酸序列编码的酶的酶活性。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的非天然存在的微生物，其中至少一种用于输入碳水化合物的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依赖的糖转运磷酸转移酶系统已被失效。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物包含糖/H⁺-同向转运体，优选地糖/H⁺-同向转运体选自蔗糖质子同向转运体、乳糖质子同向转运体和葡萄糖质子同向转运体。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的非天然存在的微生物，其中与野生型微生物相比，所述非天然存在的微生物具有增强的PEP生物合成，优选地由于PEP合酶的过表达。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物确实缺乏一种或多种选自以下的酶：功能性PEP羧化酶、功能性谷氨酸合酶、功能性WzxC蛋白、功能性UDP-葡萄糖:十一异戊烯基磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、功能性β-半乳糖苷通透酶、功能性β-半乳糖苷酶、功能性YjhC蛋白、功能性岩藻糖异构酶、功能性墨角藻糖激酶和功能性N-乙酰谷氨酰胺氨基酰化酶。