[发明专利]用于培养哺乳动物细胞的工艺

说明书

提供了用于培养哺乳动物细胞和用于生产由哺乳动物细胞表达的重组产物的工艺,其牵涉pH上移。该工艺特别适合于产业规模细胞培养和生成治疗性产品的细胞的培养。该工艺包含于第一pH进行的第一培养阶段和于比第一pH要高的第二pH进行的第二培养阶段。

本申请要求2017年11月30日提交的EP申请17204794.6的优先权,通过援引将其内容和要件收入本文用于所有目的。

发明领域

本发明涉及哺乳动物细胞培养。特别是,本发明涉及用于生产产品,诸如治疗性产品的哺乳动物细胞培养工艺。

发明背景

重组表达的生物治疗剂(包括单克隆抗体,抗原和其它专门化的蛋白质模态)越来越多地用于治疗诸如肿瘤,免疫遏制,自身免疫疾病,和炎性病症等领域中的疾病(Leaderet al.,2008；Aggarwal,2011)。由于许多这些治疗剂或“生物治疗剂”最近已经批准用于以高剂量治疗癌症和自身免疫疾病,因此需要以产业规模生产这些生物治疗剂以满足日益增长的临床需求。

重组哺乳动物细胞(尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)在制药和生物技术行业中广泛用于制造重组治疗剂。在改善哺乳动物细胞培养工艺方面已经取得进展以实现更高的体积产物产量及最佳产物质量(Omasa et al.,2010；Kim et al.,2012；Zhu,2012)。然而,治疗剂在哺乳动物细胞中的产业规模生产仍然具有挑战性。

许多重组治疗剂生产工艺使用补料-分批培养,其产生高细胞密度和高最终产物浓度。在典型的补料-分批培养条件下,细胞消耗过量的葡萄糖和氨基酸以生成生物质和产物。这经常导致大量的抑制性代谢物(诸如乳酸盐和铵)生成和在培养培养中积累。培养培养基中高浓度的这些抑制性代谢物的存在不利地影响细胞生长且能导致低细胞浓度和低产物滴度(Zhou et al.,1995；Ozturk et al.,1992；Lao and Toth,1997)。过量水平的乳酸盐和/或铵的积累还可导致更高的培养培养基渗透摩尔浓度,其能变成细胞生长的关键限制因素。高浓度的溶解二氧化碳也能负面影响细胞生长。

积累的乳酸盐可酸化细胞培养物并影响细胞生长,细胞生产力和最终产物质量。即使在受控pH条件下,积累的乳酸盐在足够高的浓度对哺乳动物细胞可能是有毒的且可在细胞培养工艺的中后期期间抑制细胞生长和蛋白质生成。当细胞密度高时特别是这样。

为了改善哺乳动物细胞培养物的总体生产力,细胞生长和代谢活性的有效控制是重要的。已经做出巨大努力以控制细胞糖酵解过程/三羧酸(TCA)循环和降低培养的细胞中的乳酸盐积累。为此,已经采取多种策略,如下:

1.使用有限量的葡萄糖,或在细胞培养过程期间维持葡萄糖于低水平以改善糖酵解/TCA循环效率和蛋白质生成(Xie and Wang,1993；Altamirano et al.,2001；Zhang etal.,2004；Maranga and Goochee,2006)。然而,Yeo等人(2006)报告低葡萄糖水平能容易地导致葡萄糖耗竭,凋亡,和过早细胞死亡。

2.使用备选的糖,诸如果糖,半乳糖,和/或其它葡萄糖类似物,试图降低过量的乳酸盐积累(Altamirano et al.,2000；Altamirano et al.,2004；Altamirano et al.,2006；Walschin and Hu,2007)。然而,这种策略还可导致更低的细胞生长速率或降低的细胞生产力。

3.调节糖酵解活性的代谢工程办法。Paredes等人(1999)描述了杂交瘤细胞系的遗传修饰以降低由细胞生成的氨和乳酸盐的量。然而,这种办法的一个主要缺点是转化细胞不稳定。

4.通过经由同源重组或siRNA技术敲低乳酸脱氢酶(LDH)表达或经由使用LDH竞争性抑制剂诸如草氨酸来调控细胞乳酸脱氢酶活性(Chen et al.,2001；Kim and Lee,2007a；Zhou et al.,2011)。