[发明专利]用于测量对G蛋白偶联受体活性的调控的方法

说明书

本发明涉及对分子调控G蛋白偶联受体(GPCR)的活性的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：‑携带一种或多种GPCR以及一种或多种G蛋白的第一膜制剂，‑GDP源或GTP源，‑用RET伴侣对的第一成员标记的G蛋白α亚基(Gα蛋白)的第一配体以及用RET伴侣对的第二成员标记的Gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空Gα蛋白或全Gα蛋白；b)对所述第一容器中发射的RET信号进行测量；c)(i)将待测试的分子以及与步骤a)中相同的反应物引入第二容器中，或者(ii)将待测试的分子引入所述第一容器中；d)对在步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发射的RET信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较。

技术领域

本发明涉及用于测量G蛋白偶联受体(GPCR)活化的调控的新方法，例如用于对分子调控GPCR活化的能力进行测定的方法。根据本发明的方法使得能够检测GPCR制剂中空G蛋白(empty G protein)或全G蛋白(full G protein)的出现或消失。

背景技术

G蛋白偶联受体(GPCR)是哺乳动物以及整个动物界的膜受体家族。G蛋白是由GPCR激活的异三聚体蛋白(3个亚基：α、β和γ)。通过GPCR，G蛋白在将信号从细胞外转导至细胞内(即，对外部刺激的细胞反应)中发挥作用。通常描述的它们的作用机理如图1所示，并总结如下：

-在其未活化状态(静息状态)中，G蛋白的α亚基与核苷酸GDP结合(与GDP结合的全G蛋白)；

-GPCR活化后，GPCR结合至G蛋白的α亚基并触发G蛋白激活过程，该过程由两个步骤构成：1)GDP离开G蛋白以产生空G蛋白，并形成未活化GPCR/空G蛋白复合体；以及2)结合GTP，从而使得活化的G蛋白(处于GTP形式，与GTP结合的全G蛋白)形成。在第一步中，与受体结合的G蛋白处于称为“空形式”的形式。因为据描述核苷酸GTP快速结合至G蛋白的α亚基，该状态在文献中被描述为暂时的。此外，活化的G蛋白的β/γ亚基与α亚基解离；

-然后，与GTP结合的全G蛋白的α亚基结合至效应物以将它们激活。效应物转而激活引起细胞反应的信号传导通路；

-然后，GTP被G蛋白α亚基水解为GDP，而α亚基与β/γ亚基重新结合以重新形成与GDP结合的全G蛋白(未活化状态)。

存在对于不同的效应物具有不同的选择性谱并由此诱导优先的信号传导通路活化的数种Gα蛋白亚型。

GPCR与许多重要的生理功能相关，并且被认为是多种疾病的优选治疗靶标之一。因此，开发出了许多体外筛选测试来鉴别能够调控GPCR的分子。开发出的测试利用了G蛋白激活的不同机制并实施了多种技术(Zhang等；Tools for GPCR drug discovery；(2012)Acta Pharmacologica Sinica)。

可特别提及使用放射性标记的配体对配体与GPCR的亲和力进行测量的亲和力测试，使用与GPCR附着的闪烁显像珠的邻近闪烁显像测试(proximity scintigraphy tests)或使用可缓慢水解或不可水解的GTP(例如GTPγS)的功能测试。然而，这些测试难以实施，并且有时需要可能限制其作为高通量筛选(HTS)分析这一用途的膜过滤步骤。