[发明专利]制造双链DNA片段的方法

说明书

本发明涉及通过双重不对称PCR(DA‑PCR)制造具有期望的碱基序列的双链DNA片段的方法。该方法具备：(1)准备各自相当于双链DNA片段的有义链的一部分的两种以上的寡核苷酸(有义寡核苷酸)和各自相当于双链DNA片段的反义链的一部分的两种以上的寡核苷酸(反义寡核苷酸)，将等浓度的各种寡核苷酸与DNA聚合酶和dNTP混合而制备反应混合液的步骤；(2)使用步骤(1)的反应混合液进行PCR的步骤；(3)向步骤(2)的反应混合液中添加能够扩增双链DNA片段的全长的引物对的步骤；和(4)使用步骤(3)的反应混合液进行PCR的步骤。

技术领域

本发明涉及制造双链DNA片段的方法，特别是涉及通过DA-PCR法制造双链DNA片段的方法。

背景技术

作为使承担遗传信息的遗传和表达等的DNA选择性扩增的方法，已知聚合酶链式反应(PCR)法。PCR中，需要目标DNA作为模板，但目标DNA并非总是能够获取。另外，为了在不同的生物中高效地表达目标DNA，需要插入限制酶切位点或者谋求宿主细胞系的密码子的最佳化。

作为该替代法，使用组装天然或人工的DNA序列来合成全基因的方法。但是，全基因合成中，为了得到最好的结果，需要进行磷酸化并利用聚丙烯酰胺凝胶纯化后的寡核苷酸，因此成本高。

作为低成本的方法，已知如下方法：使用覆盖全长分子的两条链的完整序列的、相互重叠20nt的长度40nt的寡核苷酸，通过重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE-PCR)制作全长分子，通过使用2个外侧引物的PCR对全长分子进行扩增(非专利文献1)。另外报道了：通过进行了在该方法的OE-PCR步骤之前进行连接步骤的改良的方法，用14天合成了φX174噬菌体的全长DNA(非专利文献2)。

但是，由于该方法以寡核苷酸为依据，因此，DNA序列错误的倾向高，尽管由于可以利用φX174本身作为高效的突变筛选工具而能够获得全长DNA，但该方法并非能够适用于所有基因。

报道了一种低成本的基因的合成方法，其是将双重不对称PCR(DualAsymmetrical PCR：DA-PCR)与OE-PCR组合而成的方法，该方法能够容易地自动化、简单、具有重现性且误差小(非专利文献3)。该方法的特征在于，对于4个连续地相邻的各寡核苷酸，使外侧的2个寡核苷酸为内侧的寡核苷酸的5倍摩尔过量地一起混合，进行DA-PCR。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Stemmer WP等，Gene.1995Oct 16；164(1):49-53.

非专利文献2：Hamilton O.Smith等，Proc.Natl Acad.Sci.ΜSA，December 23，2003，Vol.100，15440-15445

非专利文献3：Lei Young等，Nucleic Acids Research，2004，Vol.32，No.7 e59

发明内容

发明所要解决的问题

在扩增具有期望的碱基序列的双链DNA片段的方法中，以往的DA-PCR中一次只能使用4个连续地相邻的寡核苷酸，特别是鉴于此问题，本发明的目的在于，提供能够在DA-PCR中使用更多的相邻的寡核苷酸来扩增具有期望的碱基序列的双链DNA片段的、能够以低成本准确且高效地合成双链DNA片段的改良DA-PCR法。

用于解决问题的方法