[发明专利]用于高效生成瑞鲍迪苷的豌豆贝壳杉烯氧化酶

说明书

本发明提供了在宿主细胞中改进生成甜菊糖苷类化合物的组合物和方法。在一些实施方案，所述宿主细胞进行遗传修饰以包含编码豌豆(Pisum sativum)贝壳杉烯氧化酶或其变体贝壳杉烯氧化酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述宿主细胞还包含一种或多种异源核苷酸序列，其编码能够在所述宿主细胞中生成甜菊糖苷类化合物的途径的其他酶。本发明所述的组合物和方法提供了异源生成甜菊糖苷类化合物(包括但不限于瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的有效途径。

1.相关申请的交叉引用

本申请要求并享有于2017年8月11日提交的美国临时申请号62/544,718以及于2017年8月11日提交的国际申请号PCT/US2017/046637的优先权，其内容均通过引用其整体并入本申请。

2.发明领域

本发明涉及某些贝壳杉烯氧化酶(KO)，包含所述贝壳杉烯氧化酶的组合物，包含所述贝壳杉烯氧化酶的宿主细胞，及其用于生成瑞鲍迪苷(包括瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的方法。

3.发明背景

需要源自天然来源的零热量甜味剂来限制高糖消耗(例如，糖尿病类和肥胖症)的不良影响。瑞鲍迪苷M(RebM)是由甜叶菊植物(Stevia rebaudiana Bertoni)生成的许多甜味化合物之一。在所有的瑞鲍迪苷中，RebM具有最高的效力(比蔗糖甜约200-300倍)，口感最纯净。然而，RebM仅由甜叶菊植物少量生成，并且仅占甜菊糖苷(steviol glycoside)总含量的一小部分(1.0％)，Ohta et al.,2010,J.Appl.Glycosci.,57,199-209(2010)。因此，希望使用生物技术途径来生成RebM，从而使其能够大量且高纯度地生成。

为了使用生物技术经济地生成产品，从原料到产品的生物转化中的每个步骤需有利地具有高转化效率(理想地90％)。在我们生成RebM的酵母工程中，我们在RebM的途径中发现了明显的局限性，所述途径可将内根-贝壳杉烯(ent-kaurene)转化为异贝壳杉烯酸(kaurenoic acid)(图1A和图1B)。

KO酶存在于各种植物中，并且通常用于生成植物激素赤霉素。植物细胞中赤霉素的含量比工业生产酵母中生成的RebM的含量低几个数量级，因此，大多KO酶不能承载商业生产RebM所需的高通量。通常，来自甜叶菊(Stevia rebaudiana(Sr.KO))的KO酶(Sr.KO)已被用于在经工程化以生成RebM的酵母中将内根-贝壳杉烯转化为异贝壳杉烯酸。传统的看法是此植物生成高水平的甜菊糖苷，因此所述Sr.KO酶应该已进化为比大多数其他KO酶具有更高的转化率或处理更高的通量。

在具有高碳通量以生成RebM的酵母菌株中，发现所述Sr.KO对异贝壳杉烯酸的转化效率低(25.6％)，并且形成了很高水平的上游中间代谢物(内根-贝壳杉烯、贝壳杉烯醇、和贝壳杉烯醛)(图1C)。

为了高效且高纯度地生成RebM，需要能够高效生成异贝壳杉烯酸的改进酶。本发明提供的组合物和方法满足了此种需求，并且还提供了相关优点。

4.发明摘要

本发明提供了改进的将贝壳杉烯转化为异贝壳杉烯酸的组合物和方法。所述这些组合物和方法部分基于令人惊奇的发现，即某些贝壳杉烯氧化酶(KO)能够以非常高的效率将贝壳杉烯转化为异贝壳杉烯酸。假设市场对RebM的需求为每年50亿吨，即使使用新的KO进行应变性能方面的适度改进(例如，改进了10％)，则也可能在未来节省超过一千万美元的生产成本。

本发明所述的某些KO还能够生成含有很少或不含残留贝壳杉烯醇或贝壳杉烯醛的异贝壳杉烯酸。如此，在某些实施方案，本发明所述的组合物和方法可降低下游加工成本以得到具有高产量甜菊糖苷类化合物(例如RebM)的组合物。