[发明专利]生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在生成稳定生产细胞系中的用途

说明书

本发明涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括用编码生长因子受体的组成型活性变体的基因稳定转染细胞；还涉及在这种稳定生产细胞系中表达一种或多种POI的相应的方法；以及生长因子受体的组成型活化变体作为选择标记物在细胞培养中的用途。

本发明涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，所述方法包括用编码生长因子受体的组成型活性变体的基因稳定转染细胞；还涉及在这种稳定生产细胞系中表达一种或多种POI的相应的方法；以及生长因子受体的组成型活性变体作为选择标物记在细胞培养中的用途。

选择标记物是用于生成稳定生产细胞系(即稳定表达一种或多种POI例如生物药的细胞系)的必要工具。通常，这些选择标记物是抗生素抗性基因，其在表达载体上编码，并且与目的基因(GOI)一起稳定地整合在靶基因组中(例如通过转染)。在相应的抗生素存在的情况下培养转染的细胞用于选择具有整合表达载体的生产细胞。

用于哺乳动物表达系统的常用的基于抗生素的选择标记物包括，例如来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cerus)或土曲霉(Aspergillus terreus)的灭瘟素S抗性基因、来自转座子Tn5(neo)的G418(遗传霉素)抗性基因、来自链霉菌(Streptomyces spp.)的嘌呤霉素抗性基因、来自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的潮霉素B抗性基因和来自印度斯坦异壁链霉菌(Streptoalloteichus hindustanus)的博来霉素(Zeocin)抗性基因。

基于抗生素抗性的选择标记物的缺点包括以下事实：只有非常有限的一组选择标记物可用。此外，存在不稳定的生产克隆的问题，特别是在表达非常大的多聚体蛋白时，其中靶蛋白的重组表达随着时间的推移而沉默，从而导致生产过程中的低滴度。为了防止沉默，这些细胞可以在相应的抗生素选择剂的存在下培养。然而，在抗生素存在的情况下大规模生产POI是不希望的，因为这需要在生产后进行大量的去除步骤和分析步骤。

因此，迫切需要新的选择标记物，例如如果需要稳定整合多个表达构建体，则允许增强细胞系的稳定性并易于使用。理想地，这样的新选择标记物在没有选择剂的情况下支持POI的持续表达。

因此，本发明的技术问题是提供相应的选择标记物和使用选择标记物的方法。

通过在权利要求书中表征的实施方案来实现解决上述技术问题的方案。

特别地，第一方面，本发明涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括以下步骤：

(a)提供细胞系，

(b)同时稳定转染所述细胞系，所述细胞系具有：

(i)编码生长因子受体的组成型活性变体的基因，其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子，以及

(ii)编码所述POI的一种或多种目的基因(GOI)，以及

(c)在细胞培养基中培养所述细胞系，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子。

通常，通过结合相应的配体即相应的生长因子(例如，IGF-1、IFG-2或IGF-1R的胰岛素)而激活生长因子受体，随后的二聚化导致下游磷酸化事件以及包括MAP-激酶和NFkappaB途径在内的促生长和抗凋亡途径的激活。这些生长因子存在于血清中，并且在无血清生长培养基中培养依赖于这些因子的细胞时需要补充。表现出对IGF-1和胰岛素的生长反应的细胞包括CAP、CHO、BHK、HEK 293、Vero、MDCK细胞、杂交瘤细胞和成纤维细胞。培养这种细胞通常需要补充生长因子，这增加了相应生产过程的成本。本发明实现了一种新方法，即，在细胞培养基中稳定地整合组成型活性生长因子受体变体和通过生长因子耗竭进行的正向选择，从而允许在无蛋白质的培养基中生产。