[发明专利]用于实体瘤诊断的生物标志物绝对定量的方法和装置

说明书

本发明提供了一种定量分析样品的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供代表所述样品的一个或多个特征的单个标志物，所述样品包含所述标志物的单个单位的群体；(b)用斑点印迹分析检测标志物，其定量结果是样品中标志物的单个单位的群体的绝对量，通过样品体积或样品重量来进行标准化；(c)基于标志物的定量结果获得样品的一个或多个特征的客观性测定。另外还公开了一种参考数据库以及用于诊断患者癌症的前述参考数据库的使用方法。

相关申请

本申请的相关快速PCT要求基于2017年6月29日递交的美国临时专利申请62/526,425号的权益，并在此将该公开的内容通过参照而并入至本申请中。此外，2015年5月26号递交的美国专利申请14/721,205以及2017年2月15号递交的美国专利申请15/433,586公开的全部内容也通过参照而并入至本申请中。

技术领域

本发明涉及利用免疫印迹分析方法以临床诊断为目的而对生物标志物(biomarker)在组织水平进行定量检测的方法和装置。具体而言，本发明涉及利用定量斑点印迹(QDB：quantitative dot blot)分析对生物标志物的表达水平进行检测并且结合参考数据库分析从而针对实体瘤提供诊断和预后的方法和装置。

背景技术

蛋白质分析是现代生物学研究的重要基础。这项技术基于抗原-抗体相互作用的原理来测量目标抗原在各种医疗或实验条件下的表达水平。抗原被定义为当进入人体时能够触发免疫系统产生抗体的外来分子。抗体由于其针对特定抗原的高特异性，成为临床、制药和生物医学研究中一个有力的工具。

抗原包括但不限于，化合物、多肽、蛋白质、RNA分子、DNA分子、细胞(在原位释放的蛋白质)或病毒颗粒(在原位释放的蛋白质)。完整或部分抗原分子，可被引入到包括驴、山羊、兔子等宿主动物体内，产生大量针对目标抗原的抗体。此外，导入的抗原或抗原的一部分，可能具有一个或几个抗原决定簇，因此，由于抗原决定簇数目的不同，宿主体内可能产生一个或多个针对目标抗原的特异性抗体。

一个典型的免疫检测过程可以分为三个主要步骤。第一步是点样，将制备的含有目标抗原的样品首先转移到诸如硝酸纤维素膜、PVDF膜或像具有结合蛋白质能力的多孔板、免疫组化(IHC)中的载玻片和QDB板中的膜之类的固相载体的表面上。第二步是形成并标记目标抗原抗体复合物(例如，免疫复合物)；这一过程又包括阻塞、孵育和清洗子步骤。在阻塞子步骤，膜上的非特异性蛋白质结合位点经阻塞液(blocking buffer)处理来避免抗体非特异性结合到膜上。在免疫组化的有些情形中，在施加阻塞液前，需要进一步处理载玻片上的组织切片(脱蜡和抗原修复)。经过阻塞后，在孵育子步骤中，膜和针对目标抗原的抗体一起孵育，从而在膜上形成抗原抗体复合物；而未与目标抗原结合的抗体在这一过程中被洗掉。这里用的抗体一般是可购买的、预先标记的抗体。当然也可以通过一个标记子步骤在原位进行标记。在任一情形下使用的抗体应该被标记，通过标记物(reporter)例如标记酶(reporter enzyme)进行直接标记，或者通过由标记物标记的第二抗体进行间接标记。

第三步是检测。对标记酶发出的信号进行检测并记录，从而提供与膜结合的免疫复合物的数量或者质量相关信息。

不同的标记方法也相应地需要不同的检测方法。例如，第三步的检测反应可以是通过目测的颜色变化或者是通过扫描仪、X射线胶片或酶标仪检测的化学发光信号。在检测过程中抗体也可以通过荧光进行标记，并利用扫描仪进行检测。

蛋白质分析的多种技术都是这个典型的免疫检测法的变种。这些技术包括但不限于西式印迹分析技术、斑点免疫印迹分析技术、免疫组化(IHC)技术、酶联免疫分析(ELISA)技术、反向蛋白芯片(reverse phase protein microarray：RPPM)技术和新开发的定量斑点印迹分析(QDB)技术和载通(Zestern)技术。