[发明专利]用于高水平生产CRM的改进方法

说明书

本发明提供了用于使用具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM197的改进方法，其中该方法包括使该菌株在具有一种或多种氨基酸的无动物来源组分的培养基中生长。

技术领域

本发明涉及使用具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株以高产率生产CRM₁₉₇的改进方法。

背景技术

CRM₁₉₇是白喉毒素的遗传解毒的形式。在52位的单个突变用谷氨酸代替了甘氨酸，导致该天然毒素的ADP-核糖基转移酶活性丧失。缺乏毒性的CRM₁₉₇的结构基础已经阐明，并广泛用作结合疫苗的载体蛋白。与白喉毒素一样，CRM₁₉₇是由两个亚基(通过二硫桥键连接)组成的535个氨基酸(58.4KD)的单个多肽链。

CRM₁₉₇用作许多批准的结合疫苗如以商品名Hibtiter TM销售的b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)结合物、以商品名销售的13价肺炎球菌多糖结合物等中的载体蛋白。

Ruth M.Drew et al.,Bacteriol.1951Nov；62(5):549-59；公开了适合生产高滴度白喉毒素的化学上限定的培养基并概述了Park-Williams No.8的多伦多菌株白喉棒状杆菌的氨基酸需求。培养基含有有效替代动物来源组分即酪蛋白水解产物的氨基酸。氨基酸包括谷氨酸，胱氨酸，脯氨酸，色氨酸，亮氨酸，缬氨酸，蛋氨酸和甘氨酸。

Rappuoli et al；Applied and Environmental Microbiology 1983 Vol.46(3):560-564已经公开，非串联双溶原菌(lysogen)是稳定的并能够提供高产量的CRM₁₉₇，其比单溶原菌高多达三倍。

R Fass.et al.,Applied Microbiology and Biotechnology；April 1995,Volume 43(1):83-88；公开了一种从两种白喉棒状杆菌菌株：C7(β)(tox-201，tox-9)和C7(β)(tox-107)产生突变白喉毒素的高密度生长方法。这种方案涉及使用改良的非去铁(non-deferrated)的生长培养基，其提供细菌的快速且高密度的生长，并且当与同时消耗葡萄糖和铁结合时提高毒素生产。供应富氧空气以使细菌生长至在600nm(15-20g/L干重)下提供70的吸光度的细胞密度。培养物上清液中最大毒素浓度为150mg/L。

Parag P.Nagarkar et al.,Journal of Applied Microbiology 2002,92,215-220；公开了白喉棒状杆菌生长期间的氨基酸利用模式，并显示出所测试的九种氨基酸中只有四种，即胱氨酸，组氨酸，天冬氨酸和蛋氨酸对白喉棒状杆菌的生长和毒素产生是重要的。

欧洲专利号1 849 860B1公开了使用非动物来源的蛋白材料如来自大豆、棉籽、土豆等的蛋白，作为病原细菌培养的培养基成分。

美国专利号6,962,803B2公开了通过发酵能够产生白喉毒素的微生物菌株来纯化白喉毒素的方法，所述方法包括向生长的培养物中添加葡萄糖，由此葡萄糖的添加维持了有效支持白喉毒素生产的微生物生长。其进一步公开了，除了碳源之外，还有其他的生长的最低营养要求，包括微量金属，磷酸盐(磷酸酯，phosphate)，氮源，通常是酪蛋白氨基酸和酵母提取物。

美国专利申请公开号2011/0097359A1公开了用于培养白喉棒状杆菌菌株以生产一定水平的白喉毒素或其类似物的培养基，其中培养基基本上不含动物来源产物，并且包含：水；碳水化合物源；氮源；和多种一定初始浓度的游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的初始浓度并不限制于白喉毒素或其类似物的生产水平。进一步公开了碳水化合物源不含葡萄糖。