[发明专利]环状DNA的复制或扩增方法

权利要求书

1.一种无细胞系统中的环状DNA的复制方法，其包含以下的工序：

工序(1)：形成成为模板的环状DNA与反应液的反应混合物，所述反应液包含以下组分：

催化环状DNA的复制的第一酶组、

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶组、和

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组；和

工序(2)：使工序(1)中形成的反应混合物进行反应；

其中，该环状DNA包含能够与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin ofchromosome(oriC))、并且还包含分别相对于oriC向外插入的1对ter序列和/或被DNA多聚体分离酶识别的碱基序列，

其中，在该环状DNA具有ter序列的情况下，所述工序(1)的反应液还包含具有结合于ter序列而抑制复制的活性的蛋白质，并且，在该环状DNA具有DNA多聚体分离酶识别的碱基序列的情况下，所述工序(1)的反应液还包含DNA多聚体分离酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，DNA多聚体分离酶为Cre或XerCD。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，就分别相对于oriC向外插入的1对ter序列而言，作为一方的ter序列在oriC的5’侧插入有包含序列号1～14所示的序列中的任一序列的序列、作为另一方的ter序列在oriC的3’侧插入有包含序列号1～14所示的序列的互补序列的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，具有结合于ter序列而抑制复制的活性的蛋白质为Tus蛋白或RTP蛋白。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，XerCD识别的碱基序列为包含序列号15～24所示的序列中的任一序列的序列或其互补序列。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，Cre识别的碱基序列为包含序列号30～35所示的序列中的任一序列的序列或其互补序列。

7.一种核酸，为具有273bp～2.0kb的长度的线状DNA，包含oriC、以及分别相对于oriC向外插入的1对ter序列和/或DNA多聚体分离酶识别的碱基序列。

8.一种无细胞系统中的环状DNA的复制方法，其包含以下的工序：

工序(1)：将oriC转座子和转座酶添加到缓冲液中而形成oriC转座体，其中，oriC转座子为包含能够与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin of chromosome(oriC))的线状DNA且其两末端包含外端(OE)序列；和

使oriC转座体和不含oriC的环状DNA在缓冲液中进行反应，进行转移反应；

由此制备包含oriC的环状DNA；

工序(2)：形成(1)中得到的包含oriC的环状DNA与反应液的反应混合物，所述反应液包含以下组分：

催化环状DNA的复制的第一酶组、

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶组、和

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组；和

工序(3)：使工序(2)中形成的反应混合物进行反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，OE序列包含序列号25(5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’)所示的序列及其互补序列，在工序(1)的线状DNA的5’末端插入有包含序列号25所示的序列的OE序列，在该线状DNA的3’末端插入有包含序列号25所示的序列的互补序列的OE序列。