[发明专利]可溶性PSGL-1蛋白质变体的纯化方法

说明书

本发明公开了纯化高酸性重组蛋白质的方法。酸性蛋白质优选PSGL‑1的胞外区域或者包含该可溶性部分的融合蛋白和/或嵌合蛋白。纯化为三步层析，其包括在阴离子交换固相、疏水相互作用和羟基磷灰石上的分离。纯度和收率是最佳的，且该方法能够容易地放大并自动化。

技术领域

本发明涉及重组蛋白质纯化领域，特别涉及用于体内应用的阴离子蛋白质纯化。

背景技术

从真核表达系统纯化重组蛋白质是一个非常具有挑战性的问题。据估计，下游加工(包括目标蛋白质的提取、纯化和表征)可占总生产成本的80％或更多。达到令人满意的纯化收率和纯度水平也确实可能大大延迟了为理解任何新设计的、分离的、重组的蛋白质的潜力所需的初步研究。

事实上，尽管重组蛋白质通常以非常高的水平表达并分泌到培养基中，但是高密度的细胞生长是造成条件培养基中除感兴趣蛋白质之外的污染蛋白质和大尺寸分子存在的原因，这可能极大影响纯化过程和收率。

事实上，源自生长期间发生的细胞裂解的细胞碎片、蛋白质及其降解产物和核酸是纯化方法必须要处理的常见污染物。

在重组蛋白质纯化方法中，用抗体或特异性识别复杂混合物中的感兴趣蛋白质的其他蛋白质(即蛋白质-A)进行的亲和纯化方法是最具选择性的，至少在理论上提供了更高纯度的那些方法。尽管重组蛋白质的纯化相当普及了，但这些方法无论如何都隐藏了亲和配体从纯化柱本身泄漏出去的风险，以及这些蛋白质污染物的免疫原性风险。

P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)的复杂翻译后修饰模式需要真核表达系统来进行其功能性生产，其中对于通过P-选择素的凝集素结构域的Ca²⁺依赖性识别需要两种不同的翻译后修饰(酪氨酸硫酸化以及通过岩藻糖和唾液酸的特定核心2O-连接糖基化)。

PSGL-1是带负电荷的蛋白质，这是由于胞外区域存在至少3个酪氨酸，在功能性蛋白质中被硫酸化。功能性蛋白质的胞外区域中的高糖基化模式和唾液酸的存在进一步造成其带负电荷。

PSGL-1是白细胞粘附分子，在生理血流下介导细胞在活化内皮细胞上的栓缚(tethering)和滚动(rolling)。这种活性是白细胞外渗的重要初始步骤。PSGL-1最初被识别为P-选择素的配体，随后的工作已表明PSGL-1也是E-选择素和L-选择素的配体(参见例如美国专利第6,277,975号)。

因此，在体内诊断系统中的可能用途以及其功能表达所必需的复杂翻译后需求就代表了具有相当挑战性的问题。

已经在几种重组系统中公开了PSGL-1胞外结构域的表达，主要是作为与能够诱导二聚体形成的伴侣的嵌合蛋白，这代表了功能形式。

US 5,827,817描述了重组蛋白质的制备，其中将对应于成熟蛋白的胞外结构域(氨基酸42-320)的可溶形式PSGL-1(sPSGL-1)与IgG的Fc部分框内融合，产生结合P-选择素和E-选择素的二聚体蛋白质，并进行翻译后修饰。在同一专利实施例14中，还公开了通过强阴离子交换层析、接着低盐洗脱和凝集素亲和层析(由于它们对聚糖的亲和力)来纯化该重组产物。备选地，在US 6,933,370中描述了与嵌合蛋白的Fc部分结合的蛋白质A基质上的纯化。据说这种层析法表现出(预期的)缺点，主要是由于蛋白质A从柱中泄漏导致。

EP 1681298和EP 1681299处理了PSGL-1的重组可溶形式的纯化以及从感兴趣蛋白质中除去污染DNA的技术问题。据说通过阴离子交换层析、接着通过疏水相互作用固相层析以及通过用高盐、水醇溶液洗涤或者备选通过金属螯合层析而实现了目标。

WO01/72769 A2公开了纯化PSGL-1或PSGL-1融合蛋白的方法，其通过将这些蛋白质进行阴离子交换层析接着进行疏水相互作用层析来进行。

文献WO2014/159441 A1和WO2010/051360 A1公开了使用各种层析方法的步骤来纯化蛋白质的方法。