[发明专利]转导和扩增免疫细胞的方法及其用途

权利要求书

1.一种用于从分离血液中转导T细胞和/或NK细胞的方法，其包括：

a)富集外周血单核细胞(PBMC)以从分离血液中分离包含T细胞和/或NK细胞的PBMC；

b)在封闭系统的腔室内在有效条件下活化所分离的PBMC的T细胞和/或NK细胞，其包含有效量的抗CD3抗体和/或有效量的抗CD28；

c)在有效条件下用非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导所活化的T细胞和/或NK细胞，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞；以及

d)在细胞扩增培养基中将所述遗传修饰T细胞和/或NK细胞扩增至超过150ml的体积以及选自如下的扩增完成选择标准：乳酸浓度超过10mM、至少10倍扩增T细胞和/或NK细胞、和在细胞扩增培养基中至少4天，其中所述活化、转导和扩增在所述腔室内进行，而不在所述活化、转导和扩增之间或期间洗涤所述细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述扩增期间的任何时间进行所述扩增，而不除去超过10％的所述细胞扩增培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述活化、转导和扩增在同一腔室中进行，而不在所述活化和在细胞扩增培养基中至少7天扩增所述T细胞和/或NK细胞之间从所述腔室除去所述T细胞和/或NK细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述细胞扩增培养基中存在的N-乙酰半胱氨酸比在进行所述转导的转导反应混合物中多至少5mM。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，超过存在于进行所述活化的活化反应混合物中1/100的有效量的抗CD3抗体和/或抗CD28抗体存在于所述细胞扩增培养基中。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述活化步骤的有效条件包括所分离的PBMC的浓度为5×10⁴个PBMC/ml和4×10⁶个PBMC/ml之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述扩增后，存在的细胞数量是所述活化步骤期间存在的PBMC数量的50倍至150倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述活化和所述扩增在有效量的IL-2存在下发生。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，IL-2的所述有效量在25IU/ml和299IU/ml之间。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，以低于300国际单位/ml的浓度存在IL-2用于所述活化和扩增。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，在所述扩增开始时在所述细胞扩增培养基中存在IL-2，并在所述扩增期间将IL-2加入所述细胞扩增培养基至少两次。

12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，在所述扩增步骤期间在所述细胞扩增培养基中存在IL-7。

13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中，所述T细胞和/或NK细胞从所述活化步骤中的T细胞和/或NK细胞的数量扩增至少20倍。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒各自包含逆转录病毒基因组，所述逆转录病毒基因组包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含：

a)抗原特异性靶向区(ASTR)，

b)跨膜结构域，和

c)细胞内活化结构域。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述ASTR是微环境限制的ASTR。