[发明专利]一种自体外周血淋巴细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，具体包括以下步骤：(1)从外周血中分离外周血单个核细胞加入适量无血清细胞培养液中，并加入浓度为1000‑2000U/ml的干扰素‑γ，置于培养箱静置培养3天；(2)将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体的培养瓶中，并加入浓度为1000‑2000U/ml的干扰素‑2，静置培养3天；(3)往步骤(2)中补加500‑1000mL的细胞培养液，加入1000‑2000U/ml的干扰素‑2，静置培养3天；(4)往步骤(3)中继续补加500‑1000mL的细胞培养液，置于培养箱静置培养3天，重复此步骤2‑3次，制得自体外周淋巴细胞。本发明可以培养高扩增率以及高活性的CIK细胞，进而很好的应用至抗肿瘤过继细胞免疫治疗中。

技术领域

发明涉及淋巴细胞体外培养技术领域，具体为一种自体外周血淋巴细胞的培养方法。

背景技术

过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞(具有特异免疫力)或其产物输给细胞免疫功能低下者(如肿瘤病人)，使其获得抗肿瘤免疫力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法，而CIK是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，对于CIK细胞的良好应用被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案

但是，目前对于CIK细胞的体外培养技术存在扩增效率较低，对于癌细胞致死能力较差，主要由于多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等的种类以及剂量，甚至多种细胞因子之间的相互影响，进而对于制得的CIK细胞活性有所影响，进而使得CIK细胞无法很好的应用至抗肿瘤过继细胞免疫治疗中去，为此，我们提出了一种自体外周血淋巴细胞的培养方法。

发明内容

发明的目的在于提供一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，发明提供如下技术方案：一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，具体包括以下步骤：

(1)首先，从外周血中分离外周血单个核细胞，然后，按照密度1×10⁶加入适量无血清细胞培养液中，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-γ，置于培养箱静置培养3天，得到初次培养液；

(2)首先，将细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体进行预先包被，然后将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体的培养瓶中，等倍补加无血清细胞培养液，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，得到二次培养液；

(3)首先，将步骤(2)所得二次培养液补加500-1000mL的细胞培养液，然后加入1000-2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，制得三次培养液；

(4)首先，将步骤(3)所得三次培养液继续补加500-1000mL的细胞培养液，置于培养箱静置培养3天，重复此步骤2-3次，制得自体外周淋巴细胞。

优选的，所述步骤(1)中外周血的分离方法为：首先，将采集的每50mL外周血加入5IU肝素钠后与新鲜抗凝血10mL与Hanks液1:1混匀的混合液混合后，置于转速为1800r/min的低速台式离心机离心15min，然后，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，最后，经洗涤液洗涤2次后，按每毫升血液标本加0.2mL含20％小牛血清的Hank′s液重新混悬细胞37℃、5％CO₂孵育箱中培养2h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。

优选的，步骤(1)-(4)中静置培养的条件为温度37℃、相对湿度为100％、CO₂含量为5％的CO₂培养箱内培养。