[发明专利]一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体及其构建方法

说明书

本发明涉及一种酶活提高的金属β‑内酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明酶活提高的金属β‑内酰胺酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化金属β‑内酰胺酶分子结构、提高酶活，对于满足金属β‑内酰胺酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

自1929年青霉素发明以来，抗生素在防治细菌性疾病方面，发挥了巨大的作用。但是，由于抗生素的长期大量使用，特别是不规范地滥用抗生素，导致了日益严重的细菌耐药性问题。细菌耐药最主要的机制是产生灭活酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。β-内酰胺酶能够与β-内酰胺的羧基共价结合，使其酰胺键水解，灭活青霉素和/或头孢菌素。β-内酰胺酶种类较为复杂，到目前已发现有三百多种，并且由于超广谱β-内酰胺类抗生素的大量使用，出现了耐受超广谱β-内酰胺类抗生素的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。根据末端氨基酸序列及编码基因的位点可将β-内酰胺酶分成A、B、C和D四类：SHV属于A类，金属酶属于B类，AmpC酶属于C类，0XA型酶属于D类。A型和D型酶属于青霉素酶；C型酶属于头孢菌素酶；B型酶依靠金属离子而保持活性，因此被称为金属酶。

B型β-内酰胺酶能分解除单环类抗生素外所有的β-内酰胺类药物，即对其耐药。克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等酶抑制剂对其也不能抑制，细菌携带此酶已成为临床中的大问题。B型β-内酰胺酶，也称金属β-内酰胺酶(MβPs)，是依靠Zn²⁺或者其他重金属离子来发挥催化活性的水解酶，也是一个种类繁多的超级家族。MβPs主要产于一些病原菌，其基因属于质粒编码。

IMP和VIM是两种典型的MβPs，基因依靠质粒编码，具有很多变异型。目前MβPIMP已由最初的IMP-1演变成有26种变异体的大家族，VIM型由最初的VIM-1发展成23个变异体的体系。这两种酶不仅含有耐药的基因卡盒，还含有与转座子相关的整合子(基因转移系统)结构，可以嵌入细菌的染色体和质粒中，整合子结构可以促进整合子在质粒间的移动，质粒可以帮助耐药基因在不同细菌间传递。

近年发现的NDM-1，属于B1MβPs，是一个双核Zn结构，能水解所有β-内酰胺类抗生素，一经发现，便引起了世界卫生组织的恐慌。2008年，在一个由印度返回瑞典的病人身上采集的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中，首次发现NDM-1。在印度的肠杆菌科菌株中经常可检测到NDM-1，科学家在INCA/C、IncF、IncL/M型染色体中发现了blaNDM-1基因，这种基因可依靠结合的方式在革兰氏阴性菌之间自由地传递，但是与IMP-MPL和VIM-MPL不同的是，它没有整合子结构。到2010年8月，含有NDM-1基因的阳性菌在全球广泛传播，在南美发现的病例尤为多，大部分病菌携带者与印度等次大陆的传染病有一定联系，小部分来自于中国和南亚。目前，临床上在很多来自各种疾病(泌尿感染、败血症、肺结核、腹膜炎及软组织感染等)的肠杆菌科细菌中发现NDM-1，而且在医院和社区中都有获得性细菌感染的相关报道，可看出，携带NDM-1的细菌几乎是无孔不入的。

根据已知序列，金属β-内酰胺酶可分为B1、B2、B3个亚族。B1亚族是金属β-内酰胺酶最大的分支，其基因属于染色体编码，在铜绿假单胞菌等革兰氏阴性致病菌中可传播这种耐药基因。MOLS的底物范围很广，几乎可水解所有的β-内酰胺类抗生素，但是B2亚族金属β-内酰胺酶是一个例外，它可专一水解碳青霉烯类抗生素，此类MβPs包括lmiS、CphA和Sfh-1。B3亚族金属β-内酰胺酶跟其他两类相比，只含有9个保守的残基，主要包括从临床致病菌中得到的U、GOB-1和FEZ-1，其中GOB-1酶己经有18种变异体，在GOB酶中His16被谷氨酸盐替代，THIN-B、Mbl和BJP-1是从环境细菌中得到的。