[发明专利]生物合成3、4-二羟基苯乙酸的方法

说明书

生物合成3、4‑二羟基苯乙酸的方法涉及生物技术和代谢工程领域。本发明公开了生物合成3,4‑DHPA的途径，宿主及其方法。在所述产3,4‑DHPA的宿主中导入了3,4‑DHPA生产的代谢途径。更确切的说，是在宿主中高效表达了4‑羟基苯乙酸羟化酶(HpaBC)来生物转化4‑羟基苯乙酸为3,4‑DHPA。将所编码的基因导入宿主中，结果得到了可以利用4‑羟基苯乙酸、葡萄糖，甘油等生产3,4‑DHPA的宿主。同时本发明还公开了一种基因调控的策略，使得3,4‑DHPA的生产更为高效。

技术领域

本发明涉及生物技术和代谢工程领域，更确切的说，本发明涉及异源生物合成3、4-二羟基苯乙酸(3,4-DHPA)的代谢途径及基因调控的方法，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的外源酶，选用原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞作为宿主细胞，并通过RED重组基因编辑手段进行基因调控，最终提高了3、4-二羟基苯乙酸的产量以及碳源收率。

背景技术

酚酸因其抗氧化，抗菌和其他生物活性而广泛用于食品，化妆品和制药工业。3,4-二羟基苯乙酸是天然存在的酚酸，其表现出强大的自由基清除活性。它可以减少脂质过氧化，并且可以潜在地用作天然抗氧化剂来代替丁基化羟基甲苯(BHT)和丁基化羟基苯甲醚(BHA)以稳定食用油。 3,4-DHPA还显示了几种对健康有益的活性。它是饮食中槲皮素糖苷和黄酮类的主要生物活性分解代谢物，也是水果和蔬菜中最丰富的酚酸之一，并且对细胞凋亡，线粒体功能障碍和氧化应激等具有保护作用，能诱导胱氨酸转运酶、谷胱甘肽转运酶、血红素氧合酶、细胞色素酶等的的表达。在前列腺癌和结肠癌细胞中，3,4-DHPA还表现出强烈的抗增殖活性。此外， 3,4-DHPA还可以抑制脂多糖刺激的外周血单核细胞中促炎细胞因子的分泌和静息血小板中P-选择蛋白的表达。

尽管3,4-DHPA有着的显著的健康益处，但迄今为止还缺乏经济又环保的3,4-DHPA的生产方法。因此，有必要建立有效的合成策略，以提供足够量的3,4-DHPA化合物以用于探索和应用其多种功能。从天然来源提取3,4-DHPA受到低纯度、低效率、高成本的限制。对于化学合成，苯环上的区域选择性邻羟基化一直是具有挑战性的，并且化学合成也将面对高污染、低收率、高成本、耗时长等问题。以前的研究使用苯乙酸(PAA) 的电化学转化生产3,4-DHPA，但形成了二羟基化PAA的混合物，使产物难以分离。因此，采用绿色又高效的生物合成方法就成为了生产3,4-DHPA 最好的选择。

本发明主要目的在于实现3,4-DHPA的生物学方法的高效合成。筛选了催化效率较高的4-羟基苯乙酸3-单加氧酶HpaBC来实现从4-羟基苯乙酸到3,4-DHPA的生物转化。同样人工设计了新的代谢途径实现了3,4-DHPA 的从头合成，另外本发明还公开了一种敲除宿主基因组中编码丙酮酸激酶的基因PYKA和PYKF的基因调控策略，以及一种分别采用纯葡萄糖、纯甘油、葡萄糖与甘油混合为碳源来实现产量与生长协调的动态调控策略。实验结果表明，在优化发酵条件下，4-羟基苯乙酸到3,4-DHPA的生物转化在48h能达到100％的转化率；而通过从头合成，3,4-DHPA能达到1856±67 mg/L的最大产量以及0.1741％的最大碳源收率。

发明内容

本发明的目的是提供了高产3,4-DHPA的宿主，通过向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入一条高效生产3,4-DHPA的途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的4-羟基苯乙酸3-单加氧酶HpaBC，通过HpaBC在宿主中的高效表达，实现3,4-DHPA从4-羟基苯乙酸的生物合成。

一种生物合成3、4-二羟基苯乙酸的方法，其特征在于：在30-37℃和pH为6-8下，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶HpaBC催化3到60小时，将催化4-羟基苯乙酸生成3、4-二羟基苯乙酸。

筛选来源于细菌，真菌或经过蛋白质工程改造的编码4-羟基苯乙酸 3-单加氧酶的基因HpaBC。3、4-二羟基苯乙酸生产途径的宿主包括细菌，真菌，植物细胞或动物细胞，也包括改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞。