[发明专利]一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法

说明书

本发明公开了一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法，包括脂肪组织采集并制备、收集脐血并采集细胞组织、脂肪干细胞分离与培养、脐带间充质干细胞分离与培养、细胞混合并诱导生成软骨细胞、加入生理盐水稀释、制备并添加富血小板血浆和制得填充剂。本发明的有益效果是：脂肪干细胞与脐带间充质干细胞培养所使用的培养箱温度设为37℃，且内部充有含量为5%的CO2气体，满足干细胞生长繁殖所需成分，在混合细胞溶液内添加磁性纳米微球，并在37℃恒温下通过超声波辅助细胞分散，进一步的提高诱导分化的过程，提高诱导分化的软骨细胞的数量和质量，混合细胞的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的含量比为2:1，更有利于软骨细胞的诱导。

技术领域

本发明涉及一种填充剂制备方法，具体为一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等，临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等，一般膝关节软骨在青春期时期软骨厚度为2.5公分，随着年龄的慢慢的增长和使用劳损，软骨厚度会变得越来越薄，一般在55岁时软骨厚度只剩下仅仅0.5公分，而且如果膝关节受损或者长期受压的话，软骨厚度可能更薄，严重时还可能会出现骨刺或破裂。

随着干细胞研究的不断发展和普及，越来越多的研究者将干细胞技术扩展至骨关节炎治疗之中，通过干细胞治疗，有效的解决上述的这些问题，但是目前现有技术中所涉及到的膝关节炎干细胞药物治疗方法，仍然存在一些问题，比如在诱导分化过程中，诱导分化效果仍然较差，膝关节干细胞药物疗效仍然不稳定，治疗效果仍然不能达到我们预期的效果。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法，包括以下步骤

步骤A，脂肪组织采集并制备，筛选体检合格的供者，采用负压强度为300mmHg的水动力吸脂技术，供者局部麻醉后，在吸脂处开刀口并注入膨胀液，并在水动力的推动下，进行低负压吸脂，将脂肪组织吸入接收器，并进行冷冻保存，并将获取的脂肪静置处理，使膨胀液和筛分后的脂肪根据其比重不同自然分离，通过筛分网得到脂肪组织，并通过注射器将脂肪组织吸入注射器，得到小块脂肪组织微粒；

步骤B，收集脐血并采集细胞组织，将无菌条件下取得的足月妊娠分娩胎儿脐带,用PBS洗3次,去掉残留的血细胞，并剪成片段，取出其中的凝胶状组织；

步骤C，脂肪干细胞分离与培养，从组织中分离出脂肪干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；

步骤D，脐带间充质干细胞分离与培养，从组织中分离出脐带间充质干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；

步骤E，细胞混合并诱导生成软骨细胞，将培养后的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞倒入培养瓶，并以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；

步骤F，加入生理盐水稀释，诱导生成得软骨细胞移至离心管内，以离心得到上清液和下层细胞，弃上清液，并将下层细胞分装在多个培养瓶，依次添加生理盐水，进行稀释；

步骤G，制备并添加富血小板血浆，静脉抽取全血，第一次离心以1600r/min离心10min，丢弃红细胞层；第二次离心以5000r/min离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的1ml左右血浆重悬沉淀，得到富血小板血浆，并加入到稀释后得软骨细胞溶液内；